[發(fā)明專利]一種胃癌前狀態(tài)類器官模型的建立方法及專用培養(yǎng)基

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110667659.2
• 申請日: 2021-06-16
• 公開（公告）號: CN113234681B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 丁霞;李園;李萍;蘇澤琦;林潔;劉旭
• 申請（專利權(quán)）人: 北京中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 劉鑫鑫

1.胃癌前狀態(tài)類器官模型的建立方法，包括使用用于構(gòu)建胃癌前狀態(tài)類器官模型的培養(yǎng)基對胃黏膜腺體進行培養(yǎng)的步驟；

所述用于構(gòu)建胃癌前狀態(tài)類器官模型的培養(yǎng)基，包括胃類器官完全培養(yǎng)基和1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍；

所述1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍在所述用于構(gòu)建胃癌前狀態(tài)類器官模型的培養(yǎng)基中的濃度為25~200 μM；

以質(zhì)量濃度計，所述胃類器官完全培養(yǎng)基由下述組分組成：

50 ng/ml 表皮生長因子；

100 ng/ml 人頭蛋白；

500 ng/ml R-脊椎蛋白；

10 nM 胃泌素；

1 μM N-乙酰基-L-半胱氨酸；

100 ng/ml重組人成纖維細胞生長因子-10；

100 ng/ml 無翅型MMTV整合位點家族成員3A；

10 μM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸；

50 μg/ml L-谷氨酰胺；

100 μg/ml青鏈霉素混合溶液；

體積為Advanced DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基100倍的N2 添加劑；

體積為Advanced DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基50倍的B27添加劑；

及余量的Advanced DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

所述用于構(gòu)建胃癌前狀態(tài)類器官模型的培養(yǎng)基還包括用于溶解所述1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍的有機溶劑；所述有機溶劑為二甲基亞砜；

所述培養(yǎng)的條件為下述C1或C2：

C1：于37℃、5％CO₂濃度下培養(yǎng)5~10天；

C2：于37℃、5％CO₂濃度下培養(yǎng)5天后將胃類器官解離、重懸為單細胞后加入所述培養(yǎng)基于37℃、5％CO₂濃度下繼續(xù)培養(yǎng)3天。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法還包括取全胃，分離獲得所述胃黏膜腺體的步驟。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述分離的步驟如下：將所述全胃消化孵育后置于搖動緩沖液中進行搖動，離心，收集細胞團沉淀，得到所述胃黏膜腺體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述消化孵育的條件如下：于4℃下在5 mM的EDTA溶液中孵育1~2h；

所述搖動步驟中，每20 μL懸浮液中需達到50~100個長條狀完整胃黏膜腺體；

所述搖動緩沖液由200 ml：2 g：3 g的磷酸鹽緩沖液、山梨糖醇和蔗糖組成；

所述離心的條件如下：于4℃、300 g下離心5 min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述對胃黏膜腺體進行培養(yǎng)的步驟如下：將所述胃黏膜腺體于37℃下在基質(zhì)膠中固化15 min后加入所述用于構(gòu)建胃癌前狀態(tài)類器官模型的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。