[發明專利]一種檢測糞肥源耐藥細菌在土壤中傳播的方法及系統

在審

• 申請號: 202110667169.2
• 申請日: 2021-06-16
• 公開（公告）號: CN113388688A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 韓雪梅;郭麗;張明亮;桑文才;李婷
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/6869
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

本發明提供一種檢測糞肥源耐藥細菌在土壤中傳播的方法及系統，屬于環境微生物檢測技術領域。本發明通過提取不同處理方式下的土壤中的宏基因組DNA，進行高通量PCR、高通量測序等，從而有效檢測糞肥源耐藥細菌以及它們攜帶的ARGs種類和對應的抗生素抗性類型，避免這些潛在的耐藥細菌在農田生態系統中傳播，因此具有良好的實際應用之價值。

技術領域

本發明屬于環境微生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測糞肥源耐藥細菌在土壤中傳播的方法及系統。

背景技術

公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

畜禽糞便被作為肥料廣泛應用于農業生產，然而由于糞肥施用引起的土壤抗生素抗性傳播的問題引起了科學界的廣泛關注。糞肥引起土壤抗生素抗性傳播一方面與糞肥中含有一定量的抗生素殘留，會對土壤細菌產生選擇性壓力，從而導致土壤耐藥細菌相對富集有關；另一方面糞肥本身也含有大量的耐藥細菌，可直接向土壤中引入抗生素抗性基因(ARGs)。盡管來源于糞肥的細菌大多是厭氧的腸道菌群，很難在土壤中長期存活，但是一小部分糞肥源的細菌仍可在土壤中存活比較長的時間。

由于ARGs可以通過可移動遺傳元件(MGEs)介導的基因水平轉移機制在病原菌和非病原菌間傳播，且糞肥也是MGEs的儲存庫，因此糞肥源耐藥細菌在土壤中的存活會進一步加劇抗生素抗性的傳播，對人類健康和疾病治療構成巨大的威脅。因此有必要通過檢測糞肥來源的哪些耐藥細菌可在土壤中繼續存活，可為科學施用糞肥提供理論依據，有助于農業的健康可持續發展。

發明內容

針對現有技術存在的不足，本發明提供一種檢測糞肥源耐藥細菌在土壤中傳播的方法和系統。本發明通過提取不同處理方式下的土壤中的宏基因組DNA，進行高通量PCR、高通量測序等，從而有效檢測糞肥源耐藥細菌以及它們攜帶的ARGs種類和對應的抗生素抗性類型，避免這些潛在的耐藥細菌在農田生態系統中傳播，因此具有良好的實際應用之價值。

具體的，本發明涉及以下技術方案：

本發明的第一個方面，提供一種檢測糞肥源耐藥細菌在土壤中傳播的方法，所述方法包括：

對待測土壤樣品的DNA進行擴增及測序，以檢測糞肥源耐藥細菌以及它們攜帶的ARGs種類和對應的抗生素抗性類型。

其中，所述待測土壤樣品包括施用糞肥和未施用糞肥的土壤樣品。

具體的，所述糞肥包括但不限于豬糞肥、雞糞肥和牛糞肥。

所述方法還包括：對待測土壤樣品的DNA進行定量PCR，計算ARGs和MGEs的相對豐度。

計算ARGs和MGEs的相對豐度可使用公式2^-ΔCT的方法進行。

具體的，ΔCT＝(CT_目標ARGs-CT_{16S rRNA基因})。

本發明的第二個方面，提供一種用于檢測糞肥源耐藥細菌在土壤中傳播的系統，所述系統包括：

待測土壤樣品處理模塊，用于對土壤樣品進行施肥和不施肥處理；

DNA提取模塊，用于提取待測土壤樣品的DNA；

DNA擴增模塊，用于對上述DNA進行擴增；

DNA測序模塊，用于對擴增的DNA進行測序。

結果輸出模塊，用于輸出糞肥源耐藥細菌以及它們攜帶的ARGs種類和對應的抗生素抗性類型。