[發明專利]一種檢測糞肥源耐藥細菌在土壤中傳播的方法及系統

在審

• 申請號: 202110667169.2
• 申請日: 2021-06-16
• 公開（公告）號: CN113388688A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 韓雪梅;郭麗;張明亮;桑文才;李婷
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/6869
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

1.一種檢測糞肥源耐藥細菌在土壤中傳播的方法，其特征在于，所述方法包括：

對待測土壤樣品的DNA進行擴增及測序，以檢測糞肥源耐藥細菌以及它們攜帶的ARGs種類和對應的抗生素抗性類型；

其中，所述待測土壤樣品包括施用糞肥和未施用糞肥的土壤樣品。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述糞肥包括豬糞肥、雞糞肥和牛糞肥。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測土壤樣品制備方法包括：

采集農田土壤，在去除雜質后，過篩，并充分混合均勻；設置四種處理，分別為對照、施用豬糞處理、施用雞糞處理和施用牛糞處理，糞肥按照通常的農業施用量水平進行添加，并置于暗處進行培養，分別在培養不同時間進行破壞性采樣；

優選的，所述雜質包括樹根、石子和昆蟲；

優選的，所述過篩孔徑控制為1-3mm，優選為2mm；

優選的，培養時控制溫度為室溫，控制土壤持水量為55～65％(優選為60％)；

優選的，所述采樣時間包括培養第0、14、35、70和120天。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴增方法包括：選用帶有barcode的通用引物對對細菌16S rRNA基因進行PCR擴增；

優選的，所述引物對包括：

515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’(SEQ ID NO.1)；

909R：5’-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3’(SEQ ID NO.2)。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述測序方法包括：對高通測序得到的原始測序序列進行拼接、質量過濾和去除嵌合體，得到優化序列；將優化序列進行聚類，劃分OTU，并根據OTU的序列組成得到物種分類；基于OTU分析結果，對樣品在各個分類水平上進行分類學分析，獲得各樣品在門、綱、目、科和屬分類學水平上的種類組成信息。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：對待測土壤樣品的DNA進行定量PCR，計算ARGs和MGEs的相對豐度；

優選的，將混合好的PCR體系由SmartChip納米分配器分加到一個待用的SmartChip中，密封的SmartChip將裝到SmartChip循環儀中運行；

優選的，定量PCR反應程序為：95℃預變性10min；40個循環的95℃變性30s，60℃退火延伸30s；

優選的，只保留具有單一熔解峰和擴增效率在90％-110％間的PCR反應數據；定量PCR結果使用SmartChip qPCR軟件進行分析，將CT值31作為抗性基因是否檢出的限值標準；

優選的，計算ARGs和MGEs的相對豐度可使用公式2^-ΔCT的方法進行，包括：ΔCT＝(CT_目標ARGs-CT_{16SrRNA基因})；

優選的，在進行相關分析前，保留至少在一半的待測土壤樣品檢出的ARGs種類和細菌屬。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通過施肥處理與未施肥處理中ARGs組成的比較，分析糞肥處理中特有的ARGs種類，將糞肥處理中特有的ARGs與對應糞肥中的ARGs進行比較，獲得從糞肥向土壤中引入的ARGs種類；

通過施肥糞肥處理與未施肥處理中細菌屬組成的比較，可分析糞肥處理中特有的細菌屬，將糞肥處理中特有的細菌屬與對應糞肥中細菌屬的比較，從而獲得從糞肥向土壤中引入的細菌屬；

優選的，對土壤中糞肥源ARGs和細菌屬的相對豐度進行Pearson相關性分析，篩選極顯著相關(P0.01)的細菌屬，作為糞肥源向土壤中引入的潛在的耐藥細菌種類；

進一步優選的，所述糞肥源引入的潛在耐藥細菌包括Acinetobacter、Aquamicrobium、Cellvibrio、Clostridium、Flavobacterium、Gelidibacter、Leucobacter、Pedobacter、Pseudomonas、Psychrobacter、Serpens和Turicibacter。