[發明專利]產氣莢膜梭菌β2毒素抗體的間接ELISA方法

在審

• 申請號: 202110666321.5
• 申請日: 2021-06-16
• 公開（公告）號: CN113702639A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 曾瑾;王玉炯;吳霜;宋孚洋;李勇;馬臣杰;張思雨;馬玲玲;馬紅梅;王東;李文
• 申請（專利權）人: 寧夏大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 北京喆翙知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 孫莉莉

1.一種產氣莢膜梭菌β2毒素抗體間接ELISA檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、產氣莢膜梭菌β2毒素抗體的間接ELISA方法的建立：

(1)以包被液稀釋包被抗原至0.5μg/mL，96孔酶標板中以100μL/孔進行包被，4℃過夜，所述包被抗原為可溶性重組產氣莢膜梭菌β2毒素蛋白；

(2)PBST溶液洗板3次，每次5分鐘，加入封閉液，以200μL/孔進行封閉，37℃保溫2小時；

(3)PBST溶液洗板3次，每次5分鐘，加入待檢血清樣品，以陽性對照為產氣莢膜梭菌β2毒素單克隆抗體91/E23，陰性對照為產氣莢膜梭菌β1毒素單克隆抗體，100μL/孔，37℃保溫1小時；

(4)PBST溶液洗板3次，每次5分鐘，陽性對照孔和陰性對照孔加入HRP-山羊抗小鼠IgG為二抗，待測血清樣品孔加入相應的HRP標記二抗，100μL/孔，室溫1小時；

(5)PBST溶液洗板3次，每次5分鐘，加入鄰苯二胺溶液100μL/孔，室溫下避光10分鐘，加入終止液H₂SO₄溶液終止反應，測定OD450nm數值檢測吸光度值；

步驟二、結果判定標準的確定：

當樣品OD450nm值X+3SD時，判定為陽性；OD450nm值X+2SD時，判定為陰性；介于二者之間時，判為疑似。

2.根據權利要求1所述的一種產氣莢膜梭菌β2毒素抗體間接ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟(1)中包被液為0.85M碳酸鹽緩沖液，pH值為9.6，所述0.85M碳酸鹽緩沖液的包被液制備方法為稱取NaHCO₃ 2.93g以及Na₂CO₃ 1.59g，加蒸餾水定容至1L；所述PBST溶液為1L的PBS溶液中加入2‰Tween-20混勻制得；所述步驟(2)中封閉液為5％脫脂奶粉，所述5％脫脂奶粉的制備方法為稱取脫脂奶粉5g,，加PBS溶液定容至100mL；所述步驟(3)中陽性對照為產氣莢膜梭菌β2毒素單克隆抗體91/E23，以PBS稀釋1024倍；所述步驟(4)中HRP-山羊抗小鼠IgG二抗為HRP-山羊抗小鼠IgG稀釋2000倍，所述HRP標記相應二抗為HRP標記的山羊抗待檢動物IgG二抗稀釋2000倍；所述步驟(5)中鄰苯二胺溶液為5％鄰苯二胺溶液，所述5％鄰苯二胺溶液的制備方法包括稱取OPD(鄰苯二胺)5mg，量取10mL底物緩沖液進行溶解，加入3％H₂O₂0.15mL，現配現用，其中，所述底物緩沖液為檸檬酸緩沖液，pH值為5.0，所述檸檬酸緩沖液的制備方法包括稱取檸檬酸1.92g，Na₂HPO₄稱取2.84g，并加蒸餾水定容至100mL；所述步驟(5)中終止液為2mol/L的H₂SO₄，所述終止液的制備方法包括量取蒸餾水178.3mL，逐滴加入濃度為98％的濃硫酸21.7mL。

3.根據權利要求1所述的一種產氣莢膜梭菌β2毒素抗體間接ELISA檢測方法，其特征在于：

所述可溶性重組產氣莢膜梭菌β2毒素蛋白的包被抗原表達菌株的構建方法為：根據文獻報道的產氣莢膜梭菌β2毒素基因序列，設計引物cpb2-PF：

5`CggAATTCTAATgAAAgAAATCgACgCTTAT3`及cpb2-RF：

5`GAATgCggCCgCT gCACAATACCCTTCACC 3`，

從產氣莢膜梭菌C型標準株中擴增cpb2基因，構建至pTIG-Trx載體，轉化至BL21(DE3)菌株中，標記為BL21(DE3)pTIG-cpb2。

4.根據權利要求1所述的一種產氣莢膜梭菌β2毒素抗體間接ELISA檢測方法，其特征在于：所述包被抗原為重組產氣莢膜梭菌β2毒素蛋白；表達菌株的誘導方法為：BL21(DE3)pTIG-cpb2菌株37℃振蕩培養3小時后，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃誘導表達3h，8000rpm離心收獲菌體。