[發(fā)明專(zhuān)利]產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素抗體的間接ELISA方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110666321.5
• 申請(qǐng)日: 2021-06-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113702639A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾瑾;王玉炯;吳霜;宋孚洋;李勇;馬臣杰;張思雨;馬玲玲;馬紅梅;王東;李文
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 寧夏大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/577
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 北京喆翙知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 孫莉莉

本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法，包括步驟一、產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素抗體的間接ELISA方法的建立，步驟二、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定。本發(fā)明屬于病原微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是提供了一種特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好的檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素抗體的間接ELISA體系，為動(dòng)物的產(chǎn)氣莢膜梭菌感染情況提供了有效的檢測(cè)手段，在臨床血清流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫效果評(píng)價(jià)方面具有廣泛應(yīng)用前景，可快速檢測(cè)的產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病原微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)所引起的人及動(dòng)物的食物中毒、腸毒血癥、壞死性腸炎和氣性壞疽等疾病，是一類(lèi)世界性的人獸共患傳染病，一直受到國(guó)內(nèi)外研究者的普遍關(guān)注。

該菌的致病因子主要是菌體分泌的18種外毒素和酶；1997年，法國(guó)巴斯德研究所的Gibert在一株仔豬腸炎所分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌中發(fā)現(xiàn)了一種致死性的外毒素，定名為β2毒素；該毒素蛋白分子量為28kD，等電點(diǎn)為5.4～5.5，對(duì)蛋白酶敏感。2015年，F(xiàn)isher等利用PCR檢測(cè)方法對(duì)該毒素的編碼基因— cpb2在動(dòng)物消化道中的存在情況進(jìn)行調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在引起食物中毒，抗生素相關(guān)性腹瀉和散發(fā)性腹瀉的產(chǎn)氣莢膜梭菌A型分離株中，攜帶cpb2的菌株中有 15％可檢出同時(shí)攜帶腸毒素(cpe)基因，而在攜帶cpe基因的菌株中有超過(guò) 75％可同時(shí)檢出cpb2基因，利用該毒素的多克隆抗體的檢測(cè)的Western Blotting 技術(shù)表明，這些共同攜帶cpb2和cpe的AAD/SD分離株中有超過(guò)97％的菌株可以產(chǎn)生β2毒素。

目前多項(xiàng)研究均認(rèn)為，與健康動(dòng)物相比，在患有腸炎的人和動(dòng)物糞便中， cpb2基因存在的陽(yáng)性率更高，因此β2毒素經(jīng)常被用作產(chǎn)氣莢膜梭菌的診斷性生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。另外的測(cè)序研究顯示當(dāng)cpb2和cpe在相同的質(zhì)粒上時(shí)，菌株分泌上清對(duì)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞的毒性是cpb2和cpe在不同質(zhì)粒菌株所產(chǎn)生毒素上清的10倍，這些結(jié)果表明β2毒素可能是產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(CPE)相關(guān)的AAD/SD中的輔助毒素。

目前，對(duì)該毒素的檢測(cè)尚缺乏相關(guān)的檢測(cè)產(chǎn)品，臨床上亟需一種操作方便，敏感性高，特異性好，穩(wěn)定可靠的方法進(jìn)行養(yǎng)殖場(chǎng)動(dòng)物中產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行病學(xué)調(diào)查和抗體水平的檢測(cè)，因此，建立一種針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭β2毒素菌單克隆抗體的間接ELISA檢測(cè)方法非常有必要。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種動(dòng)物血清中產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素抗體的水平的檢測(cè)方法和材料，適用于產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素所引起的臨床血清流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫效果評(píng)價(jià)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性良好的產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：本發(fā)明一種產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素抗體間接 ELISA檢測(cè)方法，包括以下步驟：

步驟一、產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素抗體的間接ELISA方法的建立：

(1)以包被液稀釋包被抗原至0.5μg/mL，96孔酶標(biāo)板中以100μL/孔進(jìn)行包被，4℃過(guò)夜，所述包被抗原為可溶性重組產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素蛋白；

所述步驟(1)中包被液為0.85M碳酸鹽緩沖液，pH值為9.6，所述 0.85M碳酸鹽緩沖液的包被液制備方法為稱(chēng)取NaHCO₃ 2.93g以及Na₂CO₃ 1.59g，加蒸餾水定容至1L；