[發(fā)明專利]一種基于探針溶解曲線法的煙曲霉唑類耐藥分子檢測試劑盒

在審

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• 申請日: 2021-06-16
• 公開（公告）號: CN113388692A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發(fā)明（設計）人: 李姝麗;王志賢;張傲;白雪秋;閻香言;吳秀禎;盛長忠;粟艷;周澤奇
• 申請（專利權(quán)）人: 丹娜（天津）生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明提供了一種基于探針溶解曲線法的煙曲霉唑類耐藥分子檢測試劑盒。所述試劑盒中包括檢測煙曲霉唑類耐藥相關基因突變位點的引物探針組合，所述引物探針組合包括用于擴增突變位點TR34和/或TR46的第一引物對、用于擴增突變位點L98H和/或Y121F的第二引物對、用于擴增突變位點T289A的第三引物對和Taqman檢測探針。所述檢測試劑盒采用多重不對稱PCR同時擴增煙曲霉唑類耐藥突變的不同靶基因序列，再通過Taqman檢測探針溶解曲線分析鑒定，實現(xiàn)對于煙曲霉CYP51A基因的5個常見耐藥靶點的多重檢測。

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于真菌的分子生物學檢測領域，具體涉及一種基于探針溶解曲線法的煙曲霉唑類耐藥分子檢測試劑盒。

背景技術(shù)

煙曲霉(Aspergillus.fumigatus)是一種常見的致病菌種，常引起人體過敏反應、慢性和侵入性支氣管肺病等嚴重疾病。煙曲霉既可侵犯免疫功能低下人群，也能在正常人群中致病，其發(fā)病率和死亡率均較高。隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，曲霉菌的診治水平有了很大的提高。但是，近年來臨床上難治性曲霉感染病例有增加趨勢，很大一部分原因是由于煙曲霉耐藥菌株的增多。煙曲霉CYP51A基因編碼產(chǎn)物是唑類藥物作用的靶標，特定點突變能導致唑類藥物與CYP51A蛋白的親和力下降，是發(fā)生唑類耐藥的重要原因。

以培養(yǎng)為基礎的微量肉湯稀釋法、紙片擴散法等是檢測煙曲霉唑類耐藥的傳統(tǒng)方法。傳統(tǒng)方法的檢測結(jié)果可靠，無需特殊儀器，但最大弱點是費時，傳統(tǒng)培養(yǎng)時間為2～3周，藥敏試驗需要至少3天后觀察結(jié)果。所以，目前并不能在患者治療的初期及時提供精確的用藥指導信息，耽誤病人的治療。

CN109880892A公開了一種煙曲霉唑類耐藥的分子生物學快速檢測方法。該檢測方法采集臨床標本，用真菌微量DNA提取試劑盒提取真菌DNA，使用真菌ITS特異引文進行擴增，將擴增結(jié)果進行測序，blast確定標本中真菌種類，如果有煙曲霉，優(yōu)化TaqMan探針，使用realtime PCR技術(shù)檢測L98H突變型對應的核酸位點DNA第363-365bp有無突變。該發(fā)明煙曲霉唑類耐藥的分子生物學快速檢測方法，具有耗時短、敏感性好、準確性高等優(yōu)勢。然而，該方法對檢測人員的要求較高，檢測人員需要完成提取樣本、擴增等步驟，且一次只能檢測一種突變菌株，檢測效率較低。

因此，提供一種能夠準確、同時檢測多種突變型耐藥菌株的方法，對于煙曲霉感染的治療具有重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于探針溶解曲線法的煙曲霉唑類耐藥分子檢測試劑盒。所述煙曲霉唑類耐藥分子檢測試劑盒采用多重不對稱PCR同時擴增煙曲霉唑類耐藥突變的不同靶基因序列，再通過特殊設計的Taqman探針溶解曲線分析鑒定，實現(xiàn)對于CYP51A基因的5個常見的煙曲霉唑類耐藥靶點的多重檢測。

為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種檢測煙曲霉唑類耐藥相關基因突變位點的引物探針組合，所述引物探針組合包括第一引物對、第二引物對、第三引物對和檢測探針。

其中，第一引物對的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，用于擴增突變位點TR34和/或TR46；

第二引物對的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，用于擴增突變位點L98H和/或Y121F；

第三引物對的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，用于擴增突變位點T289A。

本發(fā)明提供的引物探針組合，用于對煙曲霉CYP51A基因的5個常見耐藥靶點(TR34、TR46、L98H、Y121F和T289A)的多重檢測，結(jié)合特殊設計的Taqman探針檢測煙曲霉的突變位點；其中，TR34和TR46靶點的兩條探針可共用一對引物序列；L98H和Y121F靶點的兩條探針可共用一對引物序列。