[發(fā)明專利]尼帕病毒受體結(jié)合糖蛋白及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110665886.1
• 申請日: 2021-06-16
• 公開（公告）號: CN113372454B
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金寧一;李昌;高子函;李樂天;許汪;郝鵬飛;魯會軍;李霄;田明堯
• 申請（專利權(quán)）人: 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;C07K16/10;C07K16/06;A61K39/155;A61P31/14;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 北京一枝筆知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11791
• 代理人: 張慶瑞

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及尼帕病毒受體結(jié)合糖蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明以尼帕病毒受體結(jié)合糖蛋白(G)為研究對象，利用哺乳動物細(xì)胞對其進(jìn)行可溶性表達(dá)，純化并通過免疫小鼠制備特異性血清，并通過間接ELISA鑒定結(jié)合活性。結(jié)果表明：尼帕病毒G蛋白在Expi293F細(xì)胞中獲得可溶性表達(dá)，純化得到的目的蛋白大小正確，純度大于99％；制備的抗血清能特異性結(jié)合目的蛋白。上述研究為尼帕病毒診斷與疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及尼帕病毒受體結(jié)合糖蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

尼帕病毒病是一種由尼帕病毒(NipahVirus)引起的主要侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的急性損傷，且高度致死的人獸共患傳染病，該病首次1998年暴發(fā)于馬來西亞，其病原為尼帕病毒(Nipahvirus,NiV)，由于該病毒在尼帕雙溪(Sungai Nipah)地區(qū)被分離到，因此得名。

尼帕病毒為單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)亨尼帕病毒屬(Henipavirus)成員，與另一個1994年在澳大利亞布里斯班發(fā)現(xiàn)的享德拉病毒(HendraVirus，HeV)同屬。由于對人致死率高(40％-70％)，被列為生物安全4級病原。該病毒的主要自然宿主為狐蝠科(Pteropid)的果蝠(Fruitbat)，豬、牛、馬、山羊、貓、狗、鼠、兔、狐貍、掠鳥、八哥等也是尼帕病毒的天然宿主。果蝠活動范圍較廣，NiV有可能在一定區(qū)域內(nèi)的果蝠中相互傳播，因此，相同種類蝙蝠分布的國家和地區(qū)會面臨病毒突變、疫病暴發(fā)流行的危險，自1998年首次發(fā)現(xiàn)NiV以來，NiV的流行主要分布在東南亞地區(qū)和西太平洋地區(qū)。但近幾年，西太平洋地區(qū)NiV暴發(fā)的頻率逐漸降低，而東南亞地區(qū)國家，尤其是孟加拉國地區(qū)NiV暴發(fā)非常頻繁，更引起了全世界的關(guān)注，NiV在此類周邊國家的流行態(tài)勢對我國造成了潛在威脅。我國目前尚未檢出NiV，但我國東南沿海地區(qū)和云南地區(qū)具有適合NiV流行的生態(tài)環(huán)境和宿主動物，且已發(fā)現(xiàn)NiV的自然宿主，在蝙蝠體內(nèi)存在尼帕病毒抗體，提示我國存在尼帕病毒或者類似病毒的自然疫源地。因此，開展針對NiV綜合防控關(guān)鍵技術(shù)的相關(guān)研究，具有重要的現(xiàn)實意義。

NiV病毒粒子具有多形性，有囊膜，病毒顆粒大多數(shù)呈現(xiàn)不規(guī)則的球狀，直徑大多數(shù)長約150-200nm，少數(shù)病毒顆粒呈現(xiàn)絲狀體，長度可達(dá)10000nm。NiV主要有2個遺傳譜系：NiV馬來西亞株(NiV Malaysia,NiV-MY)和NiV孟加拉株(NiVBangladesh,NiV-BD)。其中NiV-MY株基因組18246個核苷酸，而NiV-BD株基因組18252個核苷酸。目前流行毒株主要是馬來西亞株，比同屬HeV多12個堿基，編碼N(核蛋白)、P(磷蛋白)、M(基質(zhì)蛋白)、F(融合蛋白)、G(受體結(jié)合蛋白)、L(聚合酶)等至少6種蛋白，其中N蛋白、P蛋白、L聚合酶一起稱為復(fù)制復(fù)合體，結(jié)合在病毒RNA上，與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制有關(guān)，M蛋白參與維持病毒囊膜形態(tài)，F(xiàn)蛋白、G蛋白參與蛋白的融合和吸附，與病毒入侵有關(guān)。NiV在其包膜內(nèi)包含兩種膜錨定糖蛋白，G蛋白和F蛋白，其中G蛋白與宿主細(xì)胞膜蛋白ephrin-B2、ephrin-B3結(jié)合，而此兩種蛋白在宿主細(xì)胞表面高度保守，所以目前F、G為抗病毒與疫苗研究的主要靶點，NiV G蛋白全長共602個氨基酸，屬于II型跨膜糖蛋白，N末端位于膜內(nèi)，膜內(nèi)部分極短，疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域靠近N端，C末端位于膜外，由一個“球型”頭部區(qū)域和較長的“外莖”區(qū)域組成。

因此，提供可在哺乳動物細(xì)胞中可溶性表達(dá)純化尼帕病毒受體結(jié)合糖蛋白具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了尼帕病毒受體結(jié)合糖蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明以尼帕病毒受體結(jié)合糖蛋白(sG)為研究對象，利用哺乳動物細(xì)胞對其進(jìn)行可溶性表達(dá)，純化并通過免疫小鼠制備特異性血清，以期為后續(xù)開展尼帕病毒的蛋白結(jié)構(gòu)、入侵機(jī)制、診斷、疫苗及中和抗體等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：