[發明專利]一種C端帶有表位標簽M的表達載體及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202110665173.5
• 申請日: 2021-06-16
• 公開（公告）號: CN113403339B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 付碧石;趙琳;趙雯;粟碩
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/66
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 江慧

1.一種C端帶有表位標簽M的表達載體的構建方法，其特征在于，所述方法包括：

采用Xho?和Not?酶切空載pQFC -FLAG₃-SKP1，獲得帶有Xho?和Not?酶切端口的pQFC -FLAG₃；將含GFP序列載體為模板采用如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4所示的引物對進行PCR，獲得GFP基因片段；后將所述GFP基因片段采用Xho?和Not?雙酶切后與所述帶有Xho?和Not?酶切端口的pQFC -FLAG₃酶連，獲得pQFC -FLAG₃-GFP；

采用Not?和BamH?酶切所述pQFC -FLAG₃-GFP，獲得帶有Not?和BamH?酶切端口的pQFC-GFP；

將含表位標簽M序列載體為模板采用如SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：6所示的引物對進行第一退火，獲得帶有Not?和BamH?的M1片段；將所述M1片段與所述帶有Not?和BamH?酶切端口的pQFC-GFP酶連，獲得pQFC-M-GFP；

或者將含表位標簽M序列載體為模板依次采用如SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：8所示的引物對和如SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：10所示的引物對進行第二退火，獲得帶有Not?和BamH?的M₃片段；將所述M₃基因片段與所述帶有Not?和BamH?酶切端口的pQFC -GFP酶連，獲得pQFC-M₃-GFP；

用Xho?和EcoR?酶切所述pQFC-M-GFP或者所述pQFC-M₃-GFP，獲得具有Xho?和EcoR?酶切端口的線性載體pQFC-M或者pQFC-M₃；

將如SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：14所示的退火引物退火后連接到所述具有Xho?和EcoR?酶切端口的線性載體pQFC-M，得到具有Xho?、Age?、Pac?、BamH?和Not? 五個酶切位點的空載pQFC-M；

或者將如SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：15所示的退火引物退火后連接到所述具有Xho?和EcoR?酶切端口的線性載體pQFC-M₃，得到具有Xho?、Age?、Pac?、BamH?和Not?五個酶切位點的空載pQFC-M₃；

其中，所述pQF載體為以pQCXIP為表達載體骨架進行改造獲得的載體。

2.根據權利要求1所述的一種C端帶有表位標簽M的表達載體的構建方法，其特征在于，所述PCR的退火溫度為60℃，所述第一退火和第二退火的條件均包括：37℃ 30min，95℃5min，然后自然冷卻至25℃。

3.一種采用權利要求1-2任一所述方法構建獲得的一種C端帶有表位標簽M的表達載體，其特征在于，所述載體包括pQFC-M-GFP、pQFC-M₃-GFP、具有Xho?、Age?、Pac?、BamH?和Not?五個酶切位點的空載pQFC-M和具有Xho?、Age?、Pac?、BamH?和Not?五個酶切位點的空載pQFC-M₃。

4.一種權利要求3所述的C端帶有表位標簽M的表達載體在外源過表達基因檢測上的應用，其特征在于，所述應用包括在蛋白免疫印跡實驗、免疫沉淀實驗、免疫熒光實驗和流式細胞術中的應用。