[發(fā)明專利]一種C端帶有表位標(biāo)簽M的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110665173.5
• 申請(qǐng)日: 2021-06-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113403339B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付碧石;趙琳;趙雯;粟碩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/65;C12N15/66
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 江慧

本發(fā)明提供了一種C端帶有表位標(biāo)簽M的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，首先構(gòu)建C端帶有表位標(biāo)簽M的真核表達(dá)載體；將所述C端融合有所述表位標(biāo)簽的真核表達(dá)載體與編碼目標(biāo)蛋白的核苷酸序列進(jìn)行重組，獲得重組表達(dá)載體；將所述重組表達(dá)載體在所述真核生物中進(jìn)行表達(dá)；以M作為標(biāo)簽進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)、或/和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)或/和、免疫熒光實(shí)驗(yàn)或/和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)；本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體pQFC?M，pQFC?M₃，通過(guò)蛋白免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，M標(biāo)簽序列能夠被特異性識(shí)別來(lái)表征融合蛋白的表達(dá)。構(gòu)建的帶有M標(biāo)簽的表達(dá)載體為哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)領(lǐng)域提供了一種新型的通用融合標(biāo)簽載體資源，豐富了國(guó)內(nèi)的表位標(biāo)簽資源。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種C端帶有表位標(biāo)簽M的表達(dá)載體及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

1984年，1984年Munro和Pelham發(fā)表的文章第一次將抗原表位標(biāo)簽通過(guò)重組DNA的方法應(yīng)用于檢測(cè)果蠅hsp70蛋白的突變體。為了單獨(dú)觀察突變后的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的活動(dòng)，設(shè)計(jì)融合一個(gè)高敏感性和獨(dú)特性的表位標(biāo)簽于蛋白末端，用該表位標(biāo)簽所對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測(cè)。由次以后，表位標(biāo)記技術(shù)可以用來(lái)檢測(cè)沒(méi)有特異抗體的重組蛋白，同時(shí)方便科研人員檢測(cè)比較轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物和內(nèi)源基因的產(chǎn)物的異同。相較于傳統(tǒng)內(nèi)源性蛋白耗時(shí)耗力以及不可預(yù)測(cè)性，選用為標(biāo)記蛋白的標(biāo)簽抗體更容易獲得，靈敏度更高，可以通過(guò)各種生化和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)，包括流式細(xì)胞術(shù)、蛋白免疫印跡和免疫熒光染色，抗體針對(duì)每個(gè)標(biāo)記具有特異性。標(biāo)記系統(tǒng)也廣泛應(yīng)用于親和純化和免疫沉淀。

能夠用作標(biāo)簽的氨基酸序列有一定的要求。一，表位標(biāo)簽蛋白大小一般為6-30氨基酸，不會(huì)影響融合蛋白的生物活性。二，很重要的是具有能夠特異性識(shí)別該表位標(biāo)簽的高靈敏度抗體。提高靈敏度的一種方法是串聯(lián)重復(fù)標(biāo)簽序列，比如常用的3倍FLAG標(biāo)簽，串聯(lián)后的標(biāo)簽對(duì)于抗體的結(jié)合力更強(qiáng)。三，大多數(shù)標(biāo)簽為親水性，含有更多的帶電氨基酸，比如9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的HA標(biāo)簽含有兩個(gè)天冬氨酸，10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的c-myc標(biāo)簽含有三個(gè)谷氨酸，一個(gè)賴氨酸，一個(gè)天冬氨酸。表位標(biāo)簽的位置一般位于C末端或N末端，標(biāo)簽位于末端應(yīng)該能夠比插入目的蛋白內(nèi)部具有更大可能性使目的蛋白保持自身生物活性。有文獻(xiàn)報(bào)道，大致有63％的融合蛋白對(duì)于表位標(biāo)簽有良好的耐受性。同時(shí)由于大多數(shù)蛋白折疊后末端會(huì)暴露于空間結(jié)構(gòu)外部，標(biāo)簽位于末端能夠更有利于標(biāo)簽抗體的識(shí)別。目前常見(jiàn)的表位標(biāo)簽有如下幾種：

(1)c-myc，氨基酸長(zhǎng)度為10，序列為EQKLISEEDL，免疫原為人類c-myc基因408-439位產(chǎn)物，市面上對(duì)應(yīng)提供9E10抗體。

(2)FLAG，氨基酸長(zhǎng)度為8，序列為DYKDDDDK，免疫原為合成的含有腸激酶裂解位點(diǎn)的段肽，市面上對(duì)應(yīng)提供M1，M2，M3抗體。

(3)V5，氨基酸長(zhǎng)度為14，序列為GKPIPNPLLGLDS，免疫原為猿病毒5(SV5)副粘病毒P蛋白和V蛋白中分離得到，市面上對(duì)應(yīng)提供V5抗體。

(4)His6，氨基酸長(zhǎng)度為6，序列為HHHHHH，免疫原為重組的帶有His標(biāo)簽的融合蛋白，市面上對(duì)應(yīng)提供6-His，6ⅹHis，HIS-11抗體。

(5)T7，基酸長(zhǎng)度為11，序列為MASMTGGQQMG，免疫原為噬菌體T7主要衣殼蛋白的先導(dǎo)肽，市面上對(duì)應(yīng)提供抗體。

(6)HSV，基酸長(zhǎng)度為11，序列為QPELAPEDPED，免疫原為來(lái)自HSV糖蛋白D的合成肽，市面上對(duì)應(yīng)提供抗體。

由于標(biāo)簽各有優(yōu)缺點(diǎn)，所以不斷開(kāi)發(fā)新的標(biāo)簽很有必要，因此，亟需開(kāi)發(fā)一種新的表位標(biāo)簽，以能夠基本實(shí)現(xiàn)對(duì)克隆基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的對(duì)應(yīng)蛋白表達(dá)的監(jiān)測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決所述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種C端帶有表位標(biāo)簽M的表達(dá)載體及其應(yīng)用，能夠用于檢測(cè)蛋白表達(dá)。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種C端帶有表位標(biāo)簽M的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，所述方法包括：