[發(fā)明專利]一種硝磺草酮抗性菌株的篩選的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110659350.9
• 申請(qǐng)日: 2021-06-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113293122A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張磊;丁浩然;楊猷建;牛冬冬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鹽城金苗農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/36
• 分類號(hào): C12N1/36;C12N1/20;C12N9/02;C12N15/70;C12R1/06;C12R1/01
• 代理公司: 鎮(zhèn)江基德專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32306
• 代理人: 張敏

本發(fā)明的硝磺草酮抗性菌株的篩選的方法，包括以下步驟：步驟一：對(duì)表層土壤和下水道污泥的進(jìn)行采樣得到樣品，稱取2.0g樣品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mLMSM培養(yǎng)基中，在30℃，180r/m富集培養(yǎng)5d，得到培養(yǎng)物。本發(fā)明自然界微生物庫(kù)中存在廣泛的各類基因資源，本研究從除草劑污染的土壤中分離篩選到一株硝磺草酮高耐受菌株MST?5，從中克隆到硝磺草酮抗性基因Sthppd，利用E.coli BL21(DE3)對(duì)StHPPD進(jìn)行了異源表達(dá)和純化，研究了StHPPD對(duì)硝磺草酮的抗性，旨在為新型除草劑抗性基因的發(fā)掘和應(yīng)用提供基礎(chǔ)材料。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及硝磺草酮技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種硝磺草酮抗性菌株的篩選的方法。

背景技術(shù)

草甘膦和抗草甘膦作物的組合在農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域超過(guò)20年的大面積持續(xù)應(yīng)用，對(duì)全球范圍農(nóng)田雜草的控制起到了非常大的作用。然而，長(zhǎng)期高劑量使用草甘膦造成了嚴(yán)重的環(huán)境危害和巨大的選擇壓力，已經(jīng)導(dǎo)致了40多種雜草對(duì)草甘膦產(chǎn)生了抗藥性。草甘膦及其抗性基因替代組合的發(fā)掘和應(yīng)用，是植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域重要且緊迫的研究任務(wù)之一。

4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶抑制劑類除草劑是近年來(lái)新開(kāi)發(fā)的一類新型白化型除草劑，其除草機(jī)理是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制植物酪氨酸代謝途徑中HPPD的活性，從而使質(zhì)體醌和生育酚的合成受阻，間接影響了類胡蘿卜素的合成和功能，使植物光合作用不能正常進(jìn)行，導(dǎo)致雜草葉片白化，組織壞死，最終死亡。HPPD抑制劑類除草劑廣泛應(yīng)用于防治玉米田中的闊葉雜草和禾本科雜草，具有環(huán)境安全性高、作物安全性好和雜草抗性產(chǎn)生慢等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是替代草甘膦的轉(zhuǎn)基因作物靶標(biāo)除草劑。HPPD抑制劑類除草劑主要品種有硝磺草酮、苯吡唑草酮和異噁唑草酮，其中硝磺草酮是用量最大的一類。目前，巴斯夫和先正達(dá)利用來(lái)自于燕麥的HPPD突變體AvHPPD-03開(kāi)發(fā)出抗硝磺草酮的轉(zhuǎn)基因大豆SYHT0H2并已進(jìn)行了商業(yè)化生產(chǎn)，而國(guó)內(nèi)僅克隆出了3個(gè)抗HPPD基因，尚無(wú)高抗硝磺草酮的HPPD基因的報(bào)道。

基于此，本發(fā)明提供一種硝磺草酮抗性菌株的篩選的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種硝磺草酮抗性菌株的篩選的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種硝磺草酮抗性菌株的篩選的方法，包括以下步驟：

步驟一：對(duì)表層土壤和下水道污泥的進(jìn)行采樣得到樣品，稱取2.0g樣品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mL MSM培養(yǎng)基中，在30℃，180r/m富集培養(yǎng)5d，得到培養(yǎng)物；

步驟二：然后將5mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mL新鮮的MSM培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)5d，經(jīng)過(guò)連續(xù)富集馴化5輪后，吸取1mL上清培養(yǎng)液并稀釋涂布于TMSM平板上，挑取在平板上生長(zhǎng)的單菌落反復(fù)劃線，獲得純培養(yǎng)物，并經(jīng)革蘭氏染色法篩選獲得其中的陰性菌；

步驟三：純化得到的革蘭氏陰性菌株轉(zhuǎn)接至含有500μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上，挑取能在平板上生長(zhǎng)的菌株，然后轉(zhuǎn)接到新的篩選平板上，轉(zhuǎn)接過(guò)程中逐漸增加篩選平板上硝磺草酮的濃度以增加選擇壓力，最終篩選出硝磺草酮高度耐受菌株；

步驟四：以硝磺草酮高度耐受菌株基因組DNA為模板，根據(jù)引物對(duì)pET-Sthppd-F/pET-Sthppd-R，PCR擴(kuò)增其hppd基因，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，然后利用同源重組的方式克隆至線性化的pET-29a(+)載體，構(gòu)建好的pET-Sthppd表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，StHPPD重組蛋白在16℃、160r/m搖床中過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)，利用Co2+柱進(jìn)行蛋白純化；

步驟五：將純化的硝磺草酮抗性菌株進(jìn)行篩選處理。