[發明專利]一種硝磺草酮抗性菌株的篩選的方法

在審

• 申請號: 202110659350.9
• 申請日: 2021-06-15
• 公開（公告）號: CN113293122A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 張磊;丁浩然;楊猷建;牛冬冬
• 申請（專利權）人: 鹽城金苗農業科技有限公司
• 主分類號: C12N1/36
• 分類號: C12N1/36;C12N1/20;C12N9/02;C12N15/70;C12R1/06;C12R1/01
• 代理公司: 鎮江基德專利代理事務所(普通合伙) 32306
• 代理人: 張敏

1.一種硝磺草酮抗性菌株的篩選的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：對表層土壤和下水道污泥的進行采樣得到樣品，稱取2.0g樣品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mL MSM培養基中，在30℃，180r/m富集培養5d，得到培養物；

步驟二：然后將5mL培養物轉移到50mL新鮮的MSM培養基中，繼續培養5d，經過連續富集馴化5輪后，吸取1mL上清培養液并稀釋涂布于TMSM平板上，挑取在平板上生長的單菌落反復劃線，獲得純培養物，并經革蘭氏染色法篩選獲得其中的陰性菌；

步驟三：純化得到的革蘭氏陰性菌株轉接至含有500μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上，挑取能在平板上生長的菌株，然后轉接到新的篩選平板上，轉接過程中逐漸增加篩選平板上硝磺草酮的濃度以增加選擇壓力，最終篩選出硝磺草酮高度耐受菌株；

步驟四：以硝磺草酮高度耐受菌株基因組DNA為模板，根據引物對pET-Sthppd-F/pET-Sthppd-R，PCR擴增其hppd基因，對PCR產物進行回收純化，然后利用同源重組的方式克隆至線性化的pET-29a(+)載體，構建好的pET-Sthppd表達載體轉化至E.coli BL21(DE3)感受態細胞中，StHPPD重組蛋白在16℃、160r/m搖床中過夜誘導表達，利用Co2+柱進行蛋白純化；

步驟五：將純化的硝磺草酮抗性菌株進行篩選。

2.根據權利要求1所述的一種硝磺草酮抗性菌株的篩選的方法，其特征在于，所述MSM培養基的組分包括以下重量份原料：NaCl 0.5-1.0g/L，NH4Cl 0.5-1.0g/L，KH2PO4 0.3-0.7g/L，K2HPO4 1.3-1.7g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L，加超純水至1L，并調節pH至7.0。

3.根據權利要求1所述的一種硝磺草酮抗性菌株的篩選的方法，其特征在于，所述TMSM培養基為MSM培養基添加1g/L的酪氨酸。

4.根據權利要求1所述的一種硝磺草酮抗性菌株的篩選的方法，其特征在于，所述硝磺草酮抗性菌株篩選的具體步驟為：從采集的土壤樣品中共獲得了96株能以酪氨酸為唯一碳源生長的細菌，分別編號為MST-1-MST-96，然后將96株菌分別逐漸轉接至含有500-5000μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上，在500μmol/L低濃度的硝磺草酮作為選擇壓力時，從中篩選獲得了72株菌，在含有5000μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上篩選到3株菌株。

5.根據權利要求4所述的一種硝磺草酮抗性菌株的篩選的方法，其特征在于，所述TMSM平板上篩選到3株菌株分別為MST-5、MST-32和MST-66。