[發(fā)明專利]一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生菜組織培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110659231.3
• 申請日: 2021-06-15
• 公開（公告）號: CN113396821A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 武永軍;張翰卿;楊振超;梅延豪;劉齊
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué);楊凌凌宇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 李博

本發(fā)明提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生菜組織培養(yǎng)方法，屬于農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括用農(nóng)桿菌菌液侵染生菜無菌苗的外植體，將侵染后的生菜外植體相繼置于愈傷?發(fā)芽培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，馴化移栽；所述愈傷?發(fā)芽培養(yǎng)基組成為：蔗糖25.0?35.0g/L+瓊脂7.0?8.0g/L+IAA 1.0?1.5mg/L+6?BA 0.5?0.9mg/L。本發(fā)明通過特定的愈傷?發(fā)芽培養(yǎng)基，省略了共培養(yǎng)過程且不必添加抗生素，縮短了組培周期，保證了生菜組織培養(yǎng)過程中高發(fā)芽率、高生根率、低污染率和低褐化率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生菜組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

生菜(Lactuca sativa.L.)屬菊科萵苣屬萵苣種中的葉用類型，是葉用萵苣的俗稱，為一、二年生草本植物。生菜極富營養(yǎng)，含有抗氧化物、胡蘿卜素及維生素B₁、B₂、B₆和V_C、V_E，它還含有豐富的微量元素，如鈣、磷、鉀、鈉、鎂及少量的銅、鐵、鋅，此外，還含有膳食纖維素，莖葉的乳狀汁液還含有大量的有機物，如糖、有機酸、蛋白質(zhì)、苦苣素等。

生物技術(shù)在生菜育種中得到廣泛應(yīng)用，其中，在生菜上的轉(zhuǎn)基因方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和電激法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為主要的方法。穩(wěn)定的植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)再生系統(tǒng)是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因的重要前提。在現(xiàn)有的農(nóng)桿菌介導(dǎo)生菜組織培養(yǎng)體系中，常經(jīng)過無菌苗培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染、暗環(huán)境共培養(yǎng)2-3天、誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)、誘導(dǎo)發(fā)芽培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽過程。如CN106794570A公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)生菜遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基體系，將生菜子葉放到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中在28℃黑暗培養(yǎng)2天，再進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織、誘導(dǎo)發(fā)芽、生根培養(yǎng)；羅淑萍等(2005年)公開了一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉用萵苣基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立，同樣將不定芽在28℃黑暗條件下培養(yǎng)3 天，再進(jìn)行不定芽培養(yǎng)。現(xiàn)有研究通常認(rèn)為被感染的受體材料在用抗生素篩選除菌前與根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)是根癌農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)化和整合到植物染色體的關(guān)鍵時期，其共培養(yǎng)的時間長短則直接影響到目的基因的整合及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的數(shù)量，從而影響遺傳轉(zhuǎn)化率。然而，共培養(yǎng)時間過短，T-DNA轉(zhuǎn)移過程不能完成；延長共培養(yǎng)時間，農(nóng)桿菌在培養(yǎng)基及受體材料表面會過分生長，又不利于植物外植體的存活和隨后抗性愈傷組織篩選時對根癌農(nóng)桿菌的抑制。

此外，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，在培養(yǎng)過程中必須在篩選培養(yǎng)基添加抗生素以抑制農(nóng)桿菌生長，但不同的抗生素對植物轉(zhuǎn)化效率也有影響。用于抑制根癌農(nóng)桿菌生長的抗生素如羧芐青霉素、頭孢霉素等會對某些植物的轉(zhuǎn)化效率及外植體的生長和分化產(chǎn)生影響。如羧芐青霉素可刺激愈傷組織的增殖，而頭孢霉素則對雜種楊的愈傷組織形成有明顯的抑制作用。

因此，現(xiàn)有的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的生菜組織培養(yǎng)過程受到的影響因素較多，如共培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)條件、抗生素的選擇與用量等，不易人工調(diào)控，容易對組織培養(yǎng)過程產(chǎn)生負(fù)面影響，且培養(yǎng)周期過長，不利于育種工作的進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生菜組織培養(yǎng)方法，直接利用特定愈傷-發(fā)芽培養(yǎng)基對侵染生菜外植體進(jìn)行培養(yǎng)，省略了共培養(yǎng)過程，縮短生菜組織培養(yǎng)周期，且無需添加抗生素，提升愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)芽率，減少褐化率。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生菜組織培養(yǎng)方法，用農(nóng)桿菌菌液侵染生菜無菌苗的外植體，將侵染后的生菜外植體相繼置于愈傷-發(fā)芽培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，馴化移栽；所述愈傷-發(fā)芽培養(yǎng)基組成為：蔗糖25.0-35.0g/L+ 瓊脂7.0-8.0g/L+IAA 1.0-1.5mg/L+6-BA 0.5-0.9mg/L。

優(yōu)選的是，所述生菜無菌苗苗齡為5-8天。

優(yōu)選的是，所述生菜外植體為葉片。