[發(fā)明專利]3’-O-可逆封閉的核苷酸及其在無模板酶促核酸合成中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110659082.0
• 申請日: 2021-06-15
• 公開（公告）號: CN113372402A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王升啟;何小羊;王學軍;丁思敏;張千曲;黃聰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫(yī)學研究院
• 主分類號: C07H19/207
• 分類號: C07H19/207;C07H19/10;C07H1/00;C12P19/34
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 徐樂

本發(fā)明涉及酶法核酸合成領(lǐng)域，具體而言，提供了一種3’?O?可逆封閉的核苷酸及其在無模板酶促核酸合成中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的3’?O?封閉的核苷酸，其封閉基團為氰基乙烯基，氰基乙烯基的作用是實現(xiàn)核苷酸的3’?OH的可逆封閉，氰基乙烯基體積較小，結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，易于合成，成本低，同時可與TdT酶催化位點發(fā)生氫鍵相互作用，穩(wěn)定結(jié)合構(gòu)象，非常有利于TdT酶催化反應(yīng)，提高酶促核酸合成的反應(yīng)速率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶法核酸合成領(lǐng)域，具體而言，涉及一種3’-O-可逆封閉的核苷酸及其在無模板酶促核酸合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前廣泛使用的寡核苷酸合成方法是基于固相亞磷酰胺“脫保護、偶聯(lián)、蓋帽和氧化四步法”的化學合成技術(shù)。然而，由于受到合成化學技術(shù)的局限，其極限合成長度約為200nt，難以完全滿足合成生物學和DNA存儲技術(shù)等對高通量、高保真、長片段、低成本DNA合成的需求，需要進一步發(fā)展新的酶法DNA合成技術(shù)。

在DNA酶法合成中，TdT酶(DNA末端轉(zhuǎn)移酶，Terminal deoxynucleotidyltransferase)是一種可在無模板條件下，催化脫氧核糖核酸(dNTP)結(jié)合到單鏈DNA分子3’-OH端的DNA聚合酶。相較于化學法，基于TdT酶的酶法DNA合成潛力巨大：(1)TdT酶催化效率高，其無模板合成DNA單鏈長度可達8000nt，可使DNA單鏈合成長度增加數(shù)個數(shù)量級，打破化學法合成長度的限制；(2)酶法合成過程，反應(yīng)條件溫和，減少了對DNA的損傷，有助于提高DNA合成產(chǎn)物的準確性；(3)反應(yīng)過程均是在水相中進行，無需使用有毒化合物；(4)合成步驟少，循環(huán)速率更快，合成效率更高，可大幅降低合成DNA成本。此外，DNA酶法合成技術(shù)完全兼容天然DNA(3’-OH未保護的DNA)，從而實現(xiàn)對天然DNA進行人工修改。DNA酶法合成技術(shù)的發(fā)展將大幅提升合成生物學在設(shè)計和組裝基因網(wǎng)絡(luò)的能力，同時也為DNA數(shù)據(jù)存儲、DNA納米材料的設(shè)計和制造等領(lǐng)域帶來重要變革。

然而天然的TdT酶只能在DNA鏈3’-末端隨機添加dNTP，無法精確控制酶促延伸過程，不能滿足人工DNA合成需求。因此，酶法DNA合成技術(shù)的關(guān)鍵點就是通過構(gòu)建適當?shù)姆磻?yīng)體系，以實現(xiàn)控制TdT酶精確合成DNA鏈。

基于TdT酶的催化特定，一類重要的控制策略是利用可逆終止基團阻斷dNTP 3’-OH成鍵位點，實現(xiàn)對酶促DNA延伸的控制。具體來說，當DNA延伸所需的3’-OH基團被可逆終止基團阻斷時，TdT酶催化DNA鏈延伸將終止，從而達到精確控制酶促DNA合成的目的；隨后，將可逆終止基團脫保護除去，將DNA鏈3’-OH釋放出來，繼續(xù)下一輪的酶促延伸反應(yīng)，如此循環(huán)進行“停止-重啟”，實現(xiàn)TdT酶催化無模板合成目標DNA鏈。

由于在核苷酸3’-OH上引入保護基將影響底物與酶的結(jié)合，降低TdT酶催化延伸速率，因此，選取合適的可逆終止基團用于控制TdT酶促延伸是無模板DNA合成的關(guān)鍵。甲基、2-硝基芐基、烯丙基、疊氮甲基、氨基及叔丁氧基乙氧基等均可作為可逆終止保護基團，但這些保護基存在催化延伸速率低、精確度不足、脫保護效率低、相應(yīng)dNTP合成過程復(fù)雜、成本高等問題，目前，仍不能滿足工業(yè)化合成DNA的要求，未見大規(guī)模應(yīng)用于基因組的合成。因此，酶法DNA合成技術(shù)尚待進一步開發(fā)優(yōu)化，迫切需要研發(fā)基于新的可逆終止基團的無模板TdT酶法DNA合成技術(shù)。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種3’-O-封閉的核苷酸。

本發(fā)明的第二目的在于提供上述3’-O-封閉的核苷酸在酶促核酸合成中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三目的在于提供上述3’-O-封閉的核苷酸的制備方法。

本發(fā)明的第四目的在于提供上述3’-O-封閉的核苷酸的脫保護方法。

本發(fā)明的第五目的在于提供一種酶促核酸合成的方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：