[發明專利]系列低產高級醇釀酒酵母及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202110658666.6
• 申請日: 2021-06-15
• 公開（公告）號: CN113278537A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 陳葉福;江森;王歡;阮玉磊;武曉樂;郭學武;肖冬光
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12G3/022;C12R1/865
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于生物工程技術領域，涉及工業微生物的育種，尤其是系列低產高級醇釀酒酵母及其構建方法與應用，通過在出發菌株中分別采用糖誘導型啟動子P_hxt3、P_hxt4、P_hxt7、P_hxt2過表達乙醛脫氫酶ALD6基因，得到系列低產高級醇釀酒酵母。在傳統黃酒發酵中，其總高級醇(主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇)生成量與出發菌株相比分別降低了42.56％、37.84％、30.74％和19.26％。該類型啟動子受不同葡萄糖濃度的響應，可以調控ALD6基因在黃酒發酵過程中過表達從而達到降低高級醇的目的；同時抑制ALD6基因在種子培養階段的表達從而避免其對酵母生長的影響。并且生長性能、發酵性能與出發菌株沒有顯著差異。本發明所述釀酒酵母可應用于降低傳統黃酒發酵中高級醇含量，具有廣闊的市場前景。

技術領域：

本發明屬于生物工程技術領域，涉及工業微生物的育種，尤其是系列低產高級醇釀酒酵母及其構建方法與應用。

背景技術：

高級醇是黃酒中的一種重要的風味物質，和黃酒的品質直接相關。適量的高級醇對酒體呈香呈味有積極作用，但高級醇含量過高，酒體就會產生異雜味且有較強的致醉性。隨著人們物質水平的不斷提高，消費者偏向于風味、健康雙導向產品。但黃酒較其他酒而言高級醇含量較高，消費者普遍反映有易上頭、易醉等現象，這一定程度制約了黃酒行業的發展。因此控制黃酒中高級醇含量成為我國黃酒行業亟需解決的問題。

在現有的黃酒生產中，主要是通過發酵原料、氮源含量、發酵溫度、酵母接種量的傳統方法對高級醇進行控制。這些傳統的方法對生產工藝要求嚴格，不同批次間調控效果差異較大，效果并不理想。近年來，通過基因工程對釀酒酵母進行定向改造從而降低其高級醇生成量引起了廣泛的關注。高級醇主要由酵母從兩條途徑產生。一是氨基酸分解代謝途徑，即Ehrlich途徑，二是合成代謝途徑，即Harris途徑。目前已經有很多報道通過這兩條途徑對高級醇進行調控。但是這些研究一方面主要集中于對單個高級醇進行調控，無法有效控制釀酒酵母的總高級醇含量(主要包括異丁醇、異戊醇、正丙醇和苯乙醇)。比如支鏈氨基酸轉氨酶基因BAT2，該基因的敲除僅能降低酵母異丁醇和異戊醇生成量，對其他高級醇影響較小，效果并不理想。而另一方面部分研究對高級醇相關基因的改造雖然可以有效控制高級醇總量，但在此過程中對酵母生長發酵性能影響較大。比如乙醛脫氫酶基因ALD6，可以將部分高級醇的前體物質醛類氧化成為酸類物質。采用組成型強啟動子調控該基因過表達可以顯著降低釀酒酵母高級醇的生成量。但在酵母種子培養階段，較高的糖濃度有利于組成型啟動子調控ALD6基因過表達，影響了酵母的正常生長。在實際黃酒生產過程中，酵母種子培養質量非常重要，這一弊端就限制了該方法的實際應用。因此合理調控ALD6基因過表達是選育性狀優良的低產高級醇釀酒酵母菌株的一個新思路，在有效控制高級醇的同時，不影響酵母的種子培養及生長、發酵性能。這一思路可以有效控制黃酒中各類高級醇含量，并在生產應用時可以擺脫種子培養性能差的問題，具有廣闊的應用前景。

發明內容：

為解決上述技術問題，本發明提供系列啟動子過表達乙醛脫氫酶基因ALD6的新應用，即利用不同糖誘導型啟動子過表達乙醛脫氫酶基因降低釀酒酵母高級醇生成量的方法及其應用。具體是在釀酒酵母中分別通過啟動子P_hxt3、P_hxt4、P_hxt7和P_hxt2過表達乙醛脫氫酶基因實現總高級醇(包括正丙醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇)不同程度的降低。在傳統的黃酒發酵中，與出發菌株相比，總高級醇分別降低了42.56％、37.84％、30.74％和19.26％；這四種啟動子受到酵母種子培養時期初期高糖濃度(葡萄糖濃度120g/L)的抑制從而降低了該時期ALD6基因的表達量，避免了此階段對酵母生長的影響。在黃酒發酵階段，這四種啟動子受到發酵前中期低糖和中糖濃度(葡萄糖濃度10～60g/L)的誘導，相對提高了ALD6基因的表達量，達到控制高級醇生成的目的，且發酵性能不受影響。

本發明將提供一種采用上述方法或在上述方法基礎上構建的系列低產高級醇釀酒酵母菌株及其應用。