[發明專利]一種基于量子點免疫熒光檢測試劑盒制備方法

有效

• 申請號: 202110658191.0
• 申請日: 2021-06-15
• 公開（公告）號: CN113252909B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 黃磊;肖瀟;蔡偉炎
• 申請（專利權）人: 南京申基醫藥科技有限公司;新疆申基生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/558;G01N33/533;G01N33/531;G01N21/64
• 代理公司: 南京中軟知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32466
• 代理人: 鄭燕飛

1.一種基于量子點免疫熒光檢測試劑盒制備方法，試劑盒 包括玻璃纖維膜（ 1）、KIM-1檢測線（2）、NGAL檢測線（3）、mALB檢測線（4）、質控線（5）、卡殼（6）和加樣孔（7）；所述玻璃纖維膜（1）的上表面從左到右依次設置有KIM-1檢測線（2）、NGAL檢測線（3）、mALB檢測線（4）和質控線（5）；所述玻璃纖維膜（1）的外部套接設置有卡殼（6）；所述卡殼（6）的左側上表面開設加工有加樣孔（7）；所述KIM-1檢測線（2）和NGAL檢測線（3）、所述NGAL檢測線（3）和mALB檢測線（4）之間的距離為4至6毫米；所述mALB檢測線（4）和質控線（5）之間的距離為3至4毫米；在所述玻璃纖維膜（1）正上方的所述卡殼（6）上表面位置開設加工有觀測口；其特征在于，制備具體包括如下步驟：

步驟S1：首先進行活化液的配制，稱量10.66g活化劑MES于燒杯中，加入純化水1L，攪拌均勻后，用NaOH溶液調整pH至6.0，定溫到4℃，保存備用；

步驟S2：再進行偶聯液的配制，稱量1.066g活化劑MES于燒杯中，加入純化水1L，攪拌混勻后，用NaOH溶液調整pH至6.5，定溫到4℃，保存備用；

步驟S3：然后進行微球保存液配制，稱量0.718g硼酸、0.798g四硼酸鈉、10g牛血清蛋白、5g月桂醇聚氧乙烯醚-23、1g吐溫-20和50g的蔗糖于燒杯中，加入純化水1L，攪拌混勻后，用NaOH溶液調整pH至8.0，定溫到4℃，保存備用；

步驟S4：微球液配制，取1ml濃度為1umol/L，粒徑為100nm，發射波長為614nm的量子點微球加入到所述步驟S1調配好的活化液中，活化液取5ml，攪拌混勻溶解；

步驟S5：微球活化，在所述步驟S4配制好的微球溶解液中加入4mg EDC和40mg NHS，然后放入振蕩器中控制溫度25℃且轉速180rpm，活化30min，活化好后取出放入離心機控制溫度4℃且轉速15000rpm，離心30min，棄上清，再加入所述步驟S2配制好的偶聯液重懸，得到活化的熒光微球溶液；

步驟S6：KIM-1抗體偶聯液配制，將2mg KIM-1標記抗體加入到所述步驟S5配制好的熒光微球溶液當中，在振蕩器中控制溫度25℃且轉速180rpm，偶聯2h；再加入30ul的乙醇胺渦旋混勻后放入振蕩器中控制溫度25℃且轉速180rpm，振蕩1h；取出放入離心機控制溫度4℃且轉速15000rpm，離心30min，棄上清，再加入5ml含10%BSA的所述步驟S3的微球保存液，再放入振蕩器中控制溫度25℃且轉速180rpm，封閉1h；取出放入離心機控制溫度4℃且轉速15000rpm，離心30min，棄上清，再加入1ml所述步驟S3的微球保存液，即可得到KIM-1抗體標記熒光微球；

步驟S7：NGAL抗體偶聯液配制，將1.5mg NGAL標記抗體加入到所述步驟S5配制好的熒光微球溶液當中，在振蕩器中控制溫度25℃且轉速180rpm，偶聯2h；再加入30ul的乙醇胺渦旋混勻后放入振蕩器中控制溫度25℃且轉速180rpm，振蕩1h；取出放入離心機控制溫度4℃且轉速15000rpm，離心30min，棄上清，再加入5ml含10%BSA的所述步驟S3的微球保存液，再放入振蕩器中控制溫度25℃且轉速180rpm，封閉1h；取出放入離心機控制溫度4℃且轉速15000rpm，離心30min，棄上清，加入1ml所述步驟S3的微球保存液，即可得到NGAL抗體標記熒光微球；

步驟S8：mALB抗體偶聯液配制，將3mg的NGAL標記抗體加入到所述步驟S5配制好的熒光微球溶液當中，在振蕩器中控制溫度25℃且轉速180rpm，偶聯2h；再加入30ul的乙醇胺渦旋混勻后放入振蕩器中控制溫度25℃且轉速180rpm，振蕩1h；取出放入離心機控制溫度4℃且轉速15000rpm，離心30min，棄上清，再加入5ml含10%BSA的所述步驟S3的微球保存液，再放入振蕩器中控制溫度25℃且轉速180rpm，封閉1h；取出放入離心機控制溫度4℃且轉速15000rpm，離心30min，棄上清，加入1ml所述步驟S3的微球保存液，即可得到mALB抗體標記熒光微球；

步驟S9：將步驟S6、步驟S7與步驟S8所得到的各個熒光微球溶液分別按體積比值2：4：3進行混合調配，并且攪拌均勻待用；

步驟S10：玻璃纖維膜制備，將玻璃纖維膜裁成20mm*30mm的尺寸，浸泡于20mM的PB處理液中，室溫浸泡1h，然后放置在37℃的烘箱中，干燥12小時；

步驟S11：將步驟S10制備好的玻璃纖維膜放在噴金儀器上，然后將所述步驟S9混合調配的三種抗體量子點免疫熒光微球溶液噴到玻璃纖維膜上，再放入37℃烘箱干燥2小時后，即可制得成品玻璃纖維膜待后續步驟使用；

步驟S12：將步驟S6、步驟S7與步驟S8所得到的各個熒光微球溶液分別稀釋至1mg/ml、2mg/ml和1.5mg/ml的濃度，再通過噴金儀器，用0.5ul/cm的噴量依次噴劃在所述步驟S11制備的玻璃纖維膜已劃好分割線的不同區域形成KIM-1檢測線（2）、NGAL檢測線（3）和mALB檢測線（4）；將兔抗雞稀釋液稀釋至1mg/ml，再通過噴金儀器以1.5ul/cm的劃量劃在所述步驟S11制備的玻璃纖維膜已劃好分割線的區域形成質控線（5）；

步驟S13：將所述步驟S12處理后的玻璃纖維膜（1）裝入卡殼（6）內即得量子點免疫熒光檢測三聯試劑盒。