[發明專利]一種將脂肪酸轉化為β-羥基脂肪酸的人工生物催化劑

有效

• 申請號: 202110656657.3
• 申請日: 2021-06-11
• 公開（公告）號: CN113774033B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發明（設計）人: 王喜慶;嚴文亮;陳浩
• 申請（專利權）人: 合肥生融生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12P7/6409
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 劉妍妍

本發明公開了一種將脂肪酸轉化為β?羥基脂肪酸的人工生物催化劑，屬于蛋白質工程領域。本發明脂肪酸β?羥基化酶P450BSβ突變體是由野生型脂肪酸羥基化酶P450BSβ的氨基酸序列在第78位、85位、170位和290位突變得到的。本發明構建的生物催化劑能夠以高度區域選擇性和對映體選擇性的方式氧化脂肪酸的β位C?H基團。該生物催化劑具有高反應活性，以廉價的過氧化氫作為氧化劑，將底物C₁₁?C₁₈鏈長的直鏈飽和脂肪酸以及油酸和亞油酸不飽和脂肪酸轉化為相應的(R)?β?羥基脂肪酸。

技術領域

本發明涉及一種利用過氧化氫作為氧化劑將脂肪酸轉化為β-羥基脂肪酸的人工生物催化劑，屬于蛋白質工程領域。

背景技術

天然產生的β-羥基脂肪酸是一類重要的化合物，具有良好的生物活性。β- 羥基脂肪酸與氨基酸或碳水化合物結合后，可產生更多具有復雜結構和生物學意義的天然產物。β-羥基脂肪酸還可以用作合成β-氨基、β-內脂、β-內酰胺等多種生物活性的脂肪酸衍生物的前體。此外β-羥基脂肪酸的聚合可以提供聚羥基鏈烷酸酯，可以作為可降解的生物塑料。因此β-羥基脂肪酸在天然產物合成、藥物的研發和生物材料中扮演者重要的角色。

目前β-羥基脂肪酸合成主要的化學方法包括線性醛的不對稱醛醇縮合反應和β-酮酯的不對稱氫化，但這些方法需要過度金屬和復雜的催化配體或化學計量的手型助劑。利用可再生的脂肪酸資源一步氧化生成β-羥基脂肪酸是一種理想、直接且經濟的制備方法。但如何在含有多個同樣C-H基團的脂肪酸中進行特定位點和特定空間方向性的實施氧化無論在化學還是生物領域都極具挑戰性，且至今尚未實現。

雖然枯草芽孢桿菌的P450BSβ是首個被發現的能羥基脂肪酸的酶，但野生型P450BSβ的區域選擇性差，生成的1.5：1的β-和α-羥基脂肪酸。丙酮丁醇梭菌的P450CLA也可以進行羥基化，但是區域選擇性更傾向于Cα位。甲基芽孢桿菌的P450MP表現出對Cβ位的偏愛，但羥基化還會在Cα位，Cγ位，Cδ位和Cε位發生，且同時產生1-烯烴。因此，脂肪酸的高區域選擇性Cβ羥基化仍未解決，更不要說更具有挑戰性的空間選擇性。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有的技術缺陷，提供一種利用過氧化氫作為氧化劑將脂肪酸轉化為β-羥基脂肪酸的人工生物催化劑，制備的脂肪酸β-羥基酶P450BSβ突變體催化產生β-羥基脂肪酸，具有反應活性高、高區域和對映體選擇性、體系簡單、合成效率高和成本低廉等優勢。

本發明通過對P450BSβ羥基化酶的定向進化實現了對脂肪酸的未活化β位 C-H鍵的高度區域和對映選擇性地氧化。獲得的P450BSβ羥基化酶突變體能夠直接使用廉價的過氧化氫作為氧化劑，以C₁₁-C₁₈飽和脂肪酸和天然衍生的不飽和脂肪酸油酸和亞油酸為底物生成R型手性的β-羥基脂肪酸。該酶合成方法所獲得的R型β-羥基脂肪酸產物能夠作為原料通過簡單的化學方法進一步轉化為一系列的脂肪酸衍生物文庫。這些(R)-β-羥基化脂酸以及它們的衍生物在天然產物合成、藥物合成、可降解塑料、生物材料等方面有著重要的意義。為解決上述技術問題，本發明提供一種脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體，含有如SEQID NO:1所示的氨基酸序列。

本發明還提供編碼上述脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的核苷酸，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發明還提供包含上述脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的核苷酸的載體。

本發明還提供表達上述脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的基因工程菌。

本發明還提供一種獲得脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的方法，野生型脂肪酸羥基化酶P450BSβ，將第290位的甘氨酸突變成異亮氨酸，將第170位的纈氨酸突變成異亮氨酸，將第85位的谷氨酰胺突變丙氨酸，將第78位的亮氨酸突變成丙氨酸。