[發(fā)明專利]一種將脂肪酸轉(zhuǎn)化為β-羥基脂肪酸的人工生物催化劑

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110656657.3
• 申請(qǐng)日: 2021-06-11
• 公開（公告）號(hào): CN113774033B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王喜慶;嚴(yán)文亮;陳浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 合肥生融生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12P7/6409
• 代理公司: 南京縱橫知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 劉妍妍

1.一種脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體，其特征在于，含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.一種核苷酸，其特征在于，所述核苷酸編碼如權(quán)利要求1所述脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.如權(quán)利要求1所述脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的制備方法，其特征在于，將野生型的P450BSβ第290位的甘氨酸突變成異亮氨酸，將第170位的纈氨酸突變成異亮氨酸，將第85位的谷氨酰胺突變丙氨酸，將第78位的亮氨酸突變成丙氨酸。

4.如權(quán)利要求1所述脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

構(gòu)建表達(dá)野生型脂肪酸羥基化酶P450BSβ的質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中；

通過四輪定點(diǎn)飽和突變，構(gòu)建飽和突變庫，篩選到表達(dá)能夠高度區(qū)域選擇性和對(duì)映體選擇性氧化脂肪酸β位C-H基團(tuán)的P450BSβ突變體的突變質(zhì)粒；

脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的表達(dá)及純化。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的制備方法，其特征在于，脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的表達(dá)及純化包括如下步驟：

將篩選到的突變質(zhì)粒在LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，加入TB液體培養(yǎng)基擴(kuò)培，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)加入血紅素前體δ-氨基乙酰丙酸和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收菌；

用緩沖液將得到的菌體重懸，通過超聲破碎裂解細(xì)胞，離心，獲得上清液；

將上清液加入鎳離子親和柱內(nèi)，使帶有His標(biāo)簽的目的蛋白與鎳離子結(jié)合，除去雜蛋白，洗脫目的蛋白，得到脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體。

6.一種生產(chǎn)β-羥基脂肪酸的方法，其特征在于，以C₁₁-C₁₈鏈長(zhǎng)的直鏈飽和脂肪酸或不飽和的油酸、亞油酸作為底物，將過氧化氫作為氧化劑，以權(quán)利要求1所述的脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體為催化劑進(jìn)行催化反應(yīng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)β-羥基脂肪酸的方法，其特征在于，所述β-羥基脂肪酸為R型β-羥基脂肪酸。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)β-羥基脂肪酸的方法，其特征在于，催化反應(yīng)以5％乙醇作為助溶劑。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酸β-羥基化酶P450BSβ突變體在合成β-羥基脂肪酸及衍生物的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，β-羥基脂肪酸及衍生物為R型1,3-脂肪二醇、S型β-氨基脂肪酸、R型β-脂肪內(nèi)酯、S型β-羥基脂肪酸、S型β-脂肪內(nèi)酰胺。