[發明專利]一種檢測SARS-CoV-2變異毒株核酸的方法及其應用

有效

• 申請號: 202110653776.3
• 申請日: 2021-06-11
• 公開（公告）號: CN113249522B
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 楊利敏;劉文軍
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 何葉喧

本發明公開了一種檢測SARS?CoV?2變異毒株核酸的方法及其應用。發明人發現，當核苷酸G與核苷酸C互補結合后，鳥嘌呤的淬滅能力顯著降低，利用這一發現設計了一種可鑒定單堿基差異的自淬滅探針，從而突破了熒光PCR技術難以實現單堿基鑒別的技術瓶頸。本發明提供的用于檢測核酸分子中的核苷酸突變的探針，是基于所述核苷酸突變設計的，其中具有對應于所述核苷酸突變的核苷酸G，將其命名為目標G；所述探針標記有熒光染料，且所述熒光染料標記在目標G的相鄰核苷酸上。進一步，本發明可以實現對新冠病毒變異毒株的單堿基快速鑒定，對于新型冠狀病毒肺炎的變異株快速鑒別及疫情防控具有重大價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種檢測SARS-CoV-2變異毒株核酸的方法及其應用。

背景技術

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是一種可引起人新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的新發呼吸道病原體，與重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)同屬于β-冠狀病毒，具有較高的傳染性和一定的致死率。

棘突蛋白(S)是SARS-CoV-2表面最主要的糖蛋白，由S1和S2兩個亞單位組成。S1末端的受體結合域(RBD)通過與細胞表面受體血管緊張素轉化酶2(ACE2)結合,從而感染細胞啟動病毒復制。阻斷RBD與受體結合可抑制病毒復制，因此S蛋白和RBD蛋白是大部分疫苗的靶抗原。而且，已發現的大部分有效單克隆抗體也主要識別RBD區域。由于冠狀病毒屬于RNA病毒，因此具有較高的變異性。已經有越來越多的變異毒株被發現，包括首次發現于英國的B.1.1.7(501Y.V1)，發現于南非的B.1.351(501Y.V2)，發現于巴西的P.1(501Y.V3)，發現于印度的B.1.617(452R.V3)等。這些變異毒株較初期分離的野生型毒株感染性更強，而且發生于RBD區的突變會影響疫苗的保護效果，造成病毒免疫逃逸。研究證明，盡管RBD區發現了多個位點的突變，包括K417N/T、E484K和N501Y，但相比其他位點突變，位于E484位點變異會嚴重影響疫苗及抗體的保護效果，導致疫苗中和保護下降10倍以上，而且多個獲批的單克隆抗體藥物也對該位點的變異毒株失去中和活性(Antibody Resistance of SARS-CoV-2Variants B.1.351and B.1.1.7.Nature.(2021).)。因此快速鑒別E484位點變異對于疫苗接種、疫情防控及流行病學調查具有重要意義。研究證明存在免疫逃逸的變異毒株，包括B.1.351、P.1和B.1.617，均含有E484位點變異，而且這些毒株的逃逸反應均與E484位點直接相關(SARS-CoV-2spike E484K mutation reduces antibody neutralisation.LancetMicrobe(2021))。

目前對于變異毒株的鑒定主要以測序技術為主，然而由于測序技術難以實現高通量快速測定，而且對于技術和設備要求較高，因此限制了其大規模推廣應用。熒光PCR技術是應用最為廣泛的核酸檢測技術，而且目前SARS-CoV-2的核酸檢測也主要是基于TaqMan熒光PCR技術。目前國內的縣級檢測機構均已具備開展熒光PCR的條件，若能用熒光PCR實現變異毒株的快速鑒別將是最優選擇。然而TaqMan熒光PCR技術無法實現對于單堿基的鑒別，有研究人員嘗試對變異毒株進行序列分析，發現變異毒株除具備最為關注的E484位點突變外，約80％的B.1.351在ORF1a基因上還存在3675-3677堿基缺失，因此基于該堿基缺失設計了TaqMan熒光PCR檢測方法(PCR assay to enhance global surveillance for SARS-CoV-2variants of concern.medRxiv.(2021).)。由于B.1.1.7變異毒株同樣具有該堿基缺失，而且約0.03％的野生毒株也存在該缺失，因此該檢測方法的應用并不能有效區分E484位點突變毒株。而且B.1.1.7變異毒株并不會影響疫苗的免疫保護效果，因此該方法存在較大的應用限制。