[發(fā)明專利]一種低成本多能干細(xì)胞分化造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110652833.6
• 申請日: 2021-06-11
• 公開（公告）號: CN113373115A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹哲厚;韋俊;吳立前;馬悅悅
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州原生生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0789
• 分類號: C12N5/0789;C12N5/0735;C12N5/10
• 代理公司: 杭州橙知果專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33261
• 代理人: 杜放

1.一種低成本多能干細(xì)胞分化造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，包括第一階段培養(yǎng)基和第二階段培養(yǎng)基；

所述第一階段培養(yǎng)基包括DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SCF、rhG-CSF、VEGF、PDGF、FGF2、NODAL、亞硒酸鈉、L-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂鹽、AB血清；所述第一階段培養(yǎng)基中所述的SCF、rhG-CSF、VEGF、PDGF、FGF2、NODAL的終濃度比為(1-2)∶(1-2)∶(0.5-1)∶(1-2)∶(1-4)∶(1-4)；

所述第二階段培養(yǎng)基包括RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、CHIR99021、VEGF、SCF、IL-3、CSF、TGFβ1、Flt3L、EPO、胰島素以及AB血清；所述第二階段培養(yǎng)基中所述的CHIR99021、VEGF、SCF、IL-3、CSF、TGFβ1、Flt3L、EPO的終濃度比為(0.25-1)∶(1-2)∶(0.4-1.6)∶(0.4-1.6)∶(0.4-1.6)∶(0.01-0.1)∶(0.4-1.6)∶(0.4-1.6)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低成本多能干細(xì)胞分化造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的第一階段培養(yǎng)基中SCF的終濃度為50-100ng/mL、rhG-CSF的終濃度為50-100ng/mL、VEGF的終濃度為10-50ng/ml、PDGF的終濃度為50-100ng/mL、FGF2的終濃度為50-200ng/mL、NODAL的終濃度為50-200ng/mL、亞硒酸鈉的終濃度為10-100ug/mL、L-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂鹽的終濃度為50-200ng/mL、AB血清的體積分?jǐn)?shù)為10％；所述的第二階段培養(yǎng)基中CHIR99021的終濃度為1-5uM、VEGF的終濃度為50-100ng/mL、SCF的終濃度為20-80ng/mL、IL-3的終濃度為20-80ng/mL、CSF的終濃度為20-80ng/mL、TGFβ1的終濃度為0.5-5ng/mL、Flt3L的終濃度為20-80ng/mL、EPO的終濃度為20-80ng/mL、胰島素的終濃度為10-50ug/mL、AB血清的終濃度為10％。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低成本多能干細(xì)胞分化造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述第一階段培養(yǎng)基中，所述的SCF、rhG-CSF、VEGF、PDGF、FGF2、NODAL的終濃度比為1∶1∶0.5∶1∶2∶2；所述第二階段培養(yǎng)基中，所述的CHIR99021、VEGF、SCF、IL-3、CSF、TGFβ1、Flt3L、EPO的終濃度比為0.04∶1.6∶1∶1∶1∶0.04∶1∶1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低成本多能干細(xì)胞分化造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述第一階段的培養(yǎng)基中SCF的終濃度為80ng/mL、rhG-CSF的終濃度為80ng/mL、VEGF的終濃度為40ng/mL、PDGF的終濃度為80ng/mL、FGF2的終濃度為100ng/mL、NODAL的終濃度為100ng/mL、亞硒酸鈉的終濃度為20ug/mL、L-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂鹽的終濃度為100ng/mL；所述第二階段培養(yǎng)基中，CHIR99021的終濃度為2uM、VEGF的終濃度為80ng/mL、SCF的終濃度為50ng/mL、IL-3的終濃度為50ng/mL、CSF的終濃度為50ng/mL、TGFβ1的終濃度為2ng/mL、FLt3L的終濃度為50ng/mL、EPO的終濃度為50ng/mL、胰島素的終濃度為20ug/mL、AB血清的終濃度為10％。

5.一種低成本多能干細(xì)胞分化造血干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：將多能干細(xì)胞置于Aggrewell板中，并于權(quán)利要求1-4任一項所述的第一階段培養(yǎng)基中進(jìn)行第一階段的誘導(dǎo)分化成為擬胚體；

S2：將擬胚體置于權(quán)利要求1-4任一項所述的第二階段培養(yǎng)基中進(jìn)行第二階段的誘導(dǎo)分化。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的低成本多能干細(xì)胞分化造血干細(xì)胞的方法，其特征在于，將多能干細(xì)胞接種于Aggrewell板進(jìn)行擬胚體分化的第一階段培養(yǎng)記為第0天，所述第一階段的誘導(dǎo)分化自第0天開始至第4天結(jié)束，所述第二階段的誘導(dǎo)分化自第4天開始至第12天結(jié)束。