[發明專利]一種研究DNA甲基化調控重編程過程的方法

在審

• 申請號: 202110651752.4
• 申請日: 2021-06-11
• 公開（公告）號: CN113278686A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 李碧春;張晨;左其生;張亞妮;孫紅艷
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;G01N33/68;G01N33/58;G01N21/64;G01N1/30;G01N21/84
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 許必元

本發明涉及一種研究DNA甲基化調控重編程過程的方法，包括以下步驟：步驟（1）、在山中因子Oct4、Sox2、Klf4及c?Myc誘導的基礎上添加DNA甲基化酶抑制劑5’aza，按照山中伸彌提供的誘導方法對體細胞進行誘導，在不同誘導天數觀察細胞形態；步驟（2）、當觀察到出現細胞克隆時收集細胞進行熒光定量檢測、間接免疫熒光檢測、堿性磷酸酶染色、染色體核型分析和edu增殖檢測；步驟（3）、確定5’aza的效果后，將四因子和5’aza分別進行組合處理體細胞進行誘導，檢測ips克隆的形成，確定最有效的組合形式。通過本發明，通過山中因子和DNA甲基化抑制劑5’aza的不同組合誘導，探明DNA甲基化在體細胞重編程誘導中的作用。

技術領域

本發明涉及一種研究DNA甲基化調控重編程過程的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

細胞重編程是逆分化的一種過程，通過體細胞核移植、轉錄因子誘導、細胞融合、細胞質孵育等手段，可以將分化完全的體細胞重編程為全能性細胞。體細胞核移植通過收集體細胞核注入去核的卵母細胞中，將融合后的細胞進行體外培養至胚胎進而植入母體，獲得克隆動物。這種方法切實有效且能真實產生后代，但其在一定程度上違反了倫理道德，無法在人類上利用。細胞融合手段主要在植物育種和制備單克隆抗體時應用廣泛，而在動物中仍涉及倫理道德問題。而自2006年山中伸彌發現體細胞導入四個轉錄因子（Oct4，Sox2，Klf4及c-Myc），可重編程為誘導性多能干細胞后，轉錄因子誘導技術不斷發展。其無需使用卵細胞和胚胎，而僅適用人體其他細胞即可獲得多能干細胞的優勢免除了倫理爭議，因此廣受關注。而其僅從轉錄因子的角度研究了體細胞重編程的因素，大量調控因子尚未被挖掘。研究表明，添加組蛋白去乙酰化酶抑制劑VPA后，顯著提高重編程過程，仍有相當多的表觀遺傳因子有待挖掘。

發明內容

本發明的目的就是針對上述現有問題，DNA甲基化作為表觀遺傳修飾的一種，廣泛存在于各個生命過程中。在體細胞中多能性基因往往處于高甲基化狀態，表達抑制以維持體細胞穩定，而多能干細胞中DNA甲基化水平大多處于低甲基化狀態，多能性基因活躍。因此DNA甲基化無疑決定著體細胞重編程的命運，然而目前尚未有報道系統地研究DNA甲基化對體細胞重編程的調控，仍需進一步研究。通過本發明，提供一種研究DNA甲基化調控重編程過程的方法。

本發明的技術方案是：一種研究DNA甲基化調控重編程過程的方法，其特征是，包括以下步驟：

步驟（1）、在山中因子Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc誘導的基礎上添加DNA甲基化酶抑制劑5’aza，按照山中伸彌提供的誘導方法對體細胞進行誘導，在不同誘導天數觀察細胞形態；

步驟（2）、當觀察到出現細胞克隆時收集細胞進行熒光定量檢測、間接免疫熒光檢測、堿性磷酸酶染色、染色體核型分析和edu增殖檢測；

步驟（3）、確定5’aza的效果后，將四因子和5’aza分別進行組合處理體細胞進行誘導，按步驟（2）中方法檢測ips克隆的形成，確定最有效的組合形式；

在此基礎上，單獨使用5’aza進行誘導，按步驟（2）中方法檢測ips克隆形成，進一步確定DNA甲基化抑制劑的單獨誘導作用；從而有效探明DNA甲基化在重編程過程中的作用。

步驟（2）中，熒光定量檢測的方法為：收集克隆樣細胞，添加Trizol 裂解液，進行RNA提取，反轉錄為cDNA后，實時熒光定量PCR檢測Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的表達，同時檢測多能性基因的表達以及體細胞標記基因的表達；

間接免疫熒光檢測方法為：去除細胞培養孔板中的培養基，添加4%的多聚甲醛對細胞固定30min，PBS清洗后，0.1%的Triton 透膜處理15min，離心清洗后，封閉2h，加入Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc，全能性標記蛋白和體細胞標記抗體，孵育過夜，清洗后，加入二抗孵育2h，清洗后加入DAPI孵育10min，熒光倒置顯微鏡下觀察標記蛋白的表達；