[發明專利]一種研究DNA甲基化調控重編程過程的方法

在審

• 申請號: 202110651752.4
• 申請日: 2021-06-11
• 公開（公告）號: CN113278686A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 李碧春;張晨;左其生;張亞妮;孫紅艷
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;G01N33/68;G01N33/58;G01N21/64;G01N1/30;G01N21/84
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 許必元

1.一種研究DNA甲基化調控重編程過程的方法，其特征是，包括以下步驟：

步驟（1）、在山中因子Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc誘導的基礎上添加DNA甲基化酶抑制劑5’aza，按照山中伸彌提供的誘導方法對體細胞進行誘導，在不同誘導天數觀察細胞形態；

步驟（2）、當觀察到出現細胞克隆時收集細胞進行熒光定量檢測、間接免疫熒光檢測、堿性磷酸酶染色、染色體核型分析和edu增殖檢測；

步驟（3）、確定5’aza的效果后，將四因子和5’aza分別進行組合處理體細胞進行誘導，按步驟（2）中方法檢測ips克隆的形成，確定最有效的組合形式；

在此基礎上，單獨使用5’aza進行誘導，按步驟（2）中方法檢測ips克隆形成，進一步確定DNA甲基化抑制劑的單獨誘導作用；從而有效探明DNA甲基化在重編程過程中的作用。

2.根據權利要求1所述的一種研究DNA甲基化調控重編程過程的方法，其特征是，步驟（2）中，熒光定量檢測的方法為：收集克隆樣細胞，添加Trizol 裂解液，進行RNA提取，反轉錄為cDNA后，實時熒光定量PCR檢測Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的表達，同時檢測多能性基因的表達以及體細胞標記基因的表達；

間接免疫熒光檢測方法為：去除細胞培養孔板中的培養基，添加4%的多聚甲醛對細胞固定30min，PBS清洗后，0.1%的Triton 透膜處理15min，離心清洗后，封閉2h，加入Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc，全能性標記蛋白和體細胞標記抗體，孵育過夜，清洗后，加入二抗孵育2h，清洗后加入DAPI孵育10min，熒光倒置顯微鏡下觀察標記蛋白的表達；

堿性磷酸酶染色方法為：吸去培養基,PBS清洗干凈后加入ALP固定液，固定3 min，PBS清洗后，加入ALP孵育液，避光15-20 min，PBS清洗；加入核固紅染色或甲基綠染色3-5min，PBS清洗后進行鏡檢，觀察克隆細胞能否呈現堿性磷酸酶活性；

染色體核型分析方法為：將細胞克隆按5×10⁶的細胞接種在100mm口徑培養皿中，至對數期，加入0.2ml的10μmol/L秋水仙酰胺，培養4h后，棄去培養基，加入胰蛋白酶孵育3min，加入10%FBS的DMEM終止消化，離心后，加入40mmol/L KCl和25mmol/L枸櫞酸鈉的低滲液重懸，靜置后，加入等體積新鮮配制的冰冷的1:3醋酸甲醇固定液，靜置10min，立新10min后，醋酸甲醇溶液重懸；用巴氏吸管吸一滴細胞懸液，從3米處滴在用冰塊透涼的載玻片中；烘干后進行吉姆薩染色，5min后沖掉染液，觀察染色體核型；

edu增殖檢測方法為：取對數生長的細胞克隆，每孔1×10⁵細胞接種于96孔板中，持續培養；每孔加入50μM Edu培養基孵育2小時，棄培養基，PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛室溫孵育30min，棄固定液；加入甘氨酸孵育5min，清洗后加入0.5% TritonX-100的PBS孵育10min；清洗后加入1× Apollo?染色反應液，避光孵育10min，棄反應液，加入0.5% TritonX-10的PBS清洗2-3次，甲醇清洗1-2次，Hoechest 33342反應液孵育30min，PBS清洗后，進行觀察。