[發明專利]一種草地貪夜蛾種特異性引物對及試劑盒和鑒別方法

有效

• 申請號: 202110650724.0
• 申請日: 2021-06-10
• 公開（公告）號: CN113308552B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 岳碧松;王磊;張雪蓮
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 成都知棋知識產權代理事務所(普通合伙) 51325
• 代理人: 馬超前

本發明公開了一種草地貪夜蛾種特異性引物對及試劑盒和鑒別方法，該草地貪夜蛾種特異性引物對的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示。本發明基于線粒體DNA?COⅠ基因開發的草地貪夜蛾的種特異性引物，利用草地貪夜蛾、斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、粘蟲和玉米螟5種鱗翅目昆蟲對草地貪夜蛾的種特異性引物對進行種特異性檢驗，進一步建立種特異性引物與線粒體COⅠ基因通用引物的多重PCR反應體系，以COⅠ通用引物的擴增產物作為PCR反應的內對照，用于檢測所檢測材料中是否存在可供檢測的DNA，為草地貪夜蛾的快速識別與疫情監控提供技術手段。

技術領域

本發明涉及一種昆蟲鑒別方法，具體涉及一種草地貪夜蛾種特異性引物對及試劑盒和鑒別方法。

背景技術

草地貪夜蛾Spodoptera?frugiperda是一種世界性的重大農業害蟲，作為入侵種對我國的糧食安全和生態安全構成嚴重威脅，因此對草地貪夜蛾進行快速準確的識別鑒定是草地貪夜蛾綜合防控、保障農林業安全和生態環境安全的必要前提。

國內田間調查發現草地貪夜蛾常與斜紋夜蛾Spodoptera?litura、甜菜夜蛾Spodoptera?exigua、粘蟲Mythimna?separata等鱗翅目昆蟲混合發生，形態特征和為害特點均較為相似，經驗缺乏者僅從形態上難以進行區分，同時傳統的形態學鑒定方法易被蟲態(如卵、幼蟲、蛹)、殘體、亞群、性別等影響，加大草地貪夜蛾快速準確鑒定的難度。基于目前存在的問題，亟待開發特定的分子鑒定技術，補償傳統形態學鑒定的局限，提高物種鑒定的準確性和時效性。

2003年，Hebert等提出基于線粒體DNA?CO?Ⅰ基因的DNA條形碼(DNA?barcoding)對生物進行物種鑒定，該技術不受蟲態、蟲體完整性、性別等局限，且易操作實施、重復性好，已在昆蟲綱的種類鑒定中得到廣泛應用，包括鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目等31個目。2019年，張磊等利用線粒體DNA?CO?Ⅰ基因對入侵云南的草地貪夜蛾進行分子鑒定，然而該方法需要進行大量的測序、序列比對及構建系統進化樹等，步驟繁瑣、耗時長。

發明內容

本發明的目的是提供一種草地貪夜蛾種特異性引物對及試劑盒和鑒別方法，建立種特異性引物與線粒體CO?Ⅰ基因通用引物的多重PCR反應體系，以CO?Ⅰ通用引物的擴增產物作為PCR反應的內對照，用于檢測所檢測材料中是否存在可供檢測的DNA，為草地貪夜蛾的快速識別與疫情監控提供技術手段。

為了達到上述目的，本發明提供了一種草地貪夜蛾種特異性引物對，該引物對的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示。

本發明的另一目的是提供一種用于鑒別草地貪夜蛾的種特異序列，該種特異序列如SEQ?ID?NO.5所示。

本發明的另一目的是提供一種采用核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示的種特異性引物對檢測草地貪夜蛾的試劑盒。

優選地，該試劑盒中還包含核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的線粒體DNA?CO?Ⅰ通用引物對。

本發明的另一目的是提供一種基于多重PCR鑒別草地貪夜蛾的方法，該方法采用核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示的種特異性引物對及核苷酸序列如SEQ?IDNO.1和SEQ?ID?NO.2所示的線粒體DNA?CO?Ⅰ通用引物對進行多重PCR反應，若擴增得到349bp和750bp的擴增產物，則待測昆蟲為草地貪夜蛾。

優選地，該方法的多重PCR反應體系的成分包含：Taq?DNA?Polymerase、10×TaqBuffer、dNTPs、核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示的種特異性引物對、核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的線粒體DNA?CO?Ⅰ通用引物對、待測昆蟲的DNA基因組、ddH₂O。