[發明專利]基于納米孔測序平臺的組織樣本宏基因組建庫和檢測方法

有效

• 申請號: 202110650442.0
• 申請日: 2021-06-10
• 公開（公告）號: CN113249440B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 周水蓮;程彪;潘吾思;趙成娜;戶銀芝;李詩濛;任用
• 申請（專利權）人: 南京先聲醫學檢驗實驗室有限公司;北京先聲醫學檢驗實驗室有限公司;江蘇先聲診斷技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種基于納米孔測序平臺的組織樣本宏基因組建庫和檢測方法。本發明測試不同破碎管對組織以及病原體的破碎效果，發現Lysing Matrix A管可替代常規的組織研磨加Proteinase K消化過程做到組織勻漿，最終選用Lysing Matrix A管進行組織破碎勻漿后，選用Lysing Matrix E管進行病原體破壁，壓縮了組織樣本的后續宏基因組快速建庫和測序時間，滿足了臨床對于感染樣本檢測的需求，適于推廣應用。

技術領域

本發明涉及基因測序領域，特別是涉及一種基于納米孔測序平臺的組織樣本宏基因組建庫和檢測方法。

背景技術

感染性疾病是造成人類疾病和死亡的重要原因，一直備受臨床關注。新型冠狀病毒肺炎的全世界范圍大流行，給世界經濟和人類健康帶來嚴峻挑戰，讓病原的精準快速檢測成為關注的熱點。多種病原體(細菌、真菌、病毒等)均可以引起感染，病原微生物診斷的準確性、敏感性和診斷速度決定著臨床病原診斷效能。傳統臨床微生物實驗室鑒定病原體的主要方法是涂片鏡檢和培養，結合質譜、免疫和分子等技術，但其存在局限性，每類檢測均只針對特定病原體類型，難以同時對常見的細菌、真菌和病毒等病原體做到快速區分；難培養、罕見及新型病原體的檢測能力有限，無法精準用藥導致抗菌藥物耐藥問題愈發嚴重。

宏基因組測序技術可以在一次檢測中全面、無偏向性地檢出樣本中的微生物組成，發現罕見和新型病原體，為臨床決策提供更全面精確的參考。但是現有的基于二代測序技術的宏基因組分析耗時長、讀長短、拼接錯誤率高，這限制了其在臨床快檢中應用的可行性。三代測序技術PacBio在測序讀長方面有了很大提高，但其缺點在于建庫流程較為復雜，而且同二代測序一樣存在測序周期長的缺點，一輪測序結束，需要幾十個小時完成數據下機，加上后續分析時間，很難滿足病原微生物的快速鑒定。

近年來發展起來的納米孔測序技術則恰好可以彌補其他測序平臺的劣勢，其測序片段長度長、測序時間短、數據實時產生、設備小巧便攜的特點，具有提高病原微生物檢測的準確性、縮短報告周期(TURN-AROUND TIME，TAT)的特點，并適合醫院及現場檢測，契合臨床感染診斷的需求場景，有希望成為下一代的感染診斷技術。

在宏基因組的研究領域，對于組織樣本的采集，《宏基因組高通量測序技術應用于感染性疾病病原檢測中國專家共識》建議盡可能采集病灶邊緣或病變與正常交界處組織，但是實際情況組織獲取困難，樣本量非常少，且組織樣本的宿主核酸量極高，病原體reads被檢測到的數量非常少。所以，組織樣本是否充分破碎對后續實驗的成功與否有著重要影響。

組織處理的常規流程(比如組織基因組DNA提取等一些成熟的商業化試劑盒)用研磨杵將組織徹底研磨(如組織較難徹底研磨，可選用電動或玻璃勻漿器)，再加入Proteinase K混勻后，在56℃或者65℃放置，直至組織溶解。不同組織裂解時間不同，通常需65℃孵育2小時左右或者難消化的組織甚至需要56℃過夜孵育。

組織處理的常規流程在實際操作過程中存在以下幾點問題：

1.步驟比較復雜。一般常規的組織處理操作流程，在組織中加入PBS，蓋緊EP管蓋，來回顛倒EP管4～5次，吸棄液體。重復上述步驟兩次后，再次加入PBS研磨，然后再加入Proteinase K孵育。2.手動研磨組織困難。一般常規的組織處理需要使用高溫滅菌后的無菌研磨杵將組織充分研磨至米糊狀，需要花費數小時不等，人工研磨很困難，且也不能滿足商業化多樣本快速處理要求。3.可能影響建庫成功率和病原檢出率。如果樣本處理過程中手動研磨不均勻，容易導致后續宿主去處不干凈，影響組織樣本建庫成功率以及病原檢出率。4.操作時間過長，不能滿足感染樣本對時效性的需求。手動研磨組織因樣本情況不同差異比較大，通常需要數小時不等。此外，常規的組織處理過程在研磨后還需要加入Proteinase K，再置于65℃金屬浴震蕩孵育2小時或者56℃震蕩孵育過夜，消化至無可見塊狀組織。