[發明專利]一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法

在審

• 申請號: 202110647841.1
• 申請日: 2021-06-10
• 公開（公告）號: CN113390805A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 何席偉;張徐祥;周嘉偉;侯俊青
• 申請（專利權）人: 南京大學;南京大學宜興環保研究院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N33/535;G01N1/40
• 代理公司: 江蘇瑞途律師事務所 32346
• 代理人: 王琳琳;陳彬

本發明提供了一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法，屬于檢測分析領域。所述方法包括毒性檢測方法和毒性評估體系，其中毒性檢測方法基于乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制原理，采用電鰻AChE體外暴露方式，結合微板法操作，快速檢測受試水樣的神經毒性；毒性評估體系采用滅多威當量轉換，結合滅多威排放限值，以當量區間定量表征受試水樣的神經毒性級別。本發明方法從體外生物試驗角度綜合考察水樣神經毒性，不僅能夠在單次操作中快速批量檢測多個水樣，而且可將毒性結果進行定量表征，從而快速評估水樣神經毒性等級。

技術領域

本發明屬于檢測分析領域，具體地，涉及一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法。

背景技術

市政污水和工業廢水成分復雜，常含有多種有毒有害污染物，排放到環境后會對生物體產生一定的毒害作用，對生態系統及人類健康都造成重大威脅。目前水質監測除氮、磷、COD等常規指標外，在化學監測上主要關注高風險污染物的含量。然而化學監測無法涵蓋水中存在的所有化學物質，并且由于不同化學物對生物體產生的毒害作用機制不盡相同，使得通過單純化學監測無法評估水中大量污染物的綜合毒性效應。近年來，以廢水毒性作為廢水污染水平的一種衡量方式越來越受到人們關注，廢水毒性控制也成為目前廢水處理與安全再生領域的熱點。隨著廢水毒性監測越來越朝向常規水質監測發展，開發高通量快速檢測和評估水樣毒性的方法具有重要意義，尤其針對水樣的批量處理。

多種具有神經毒性的污染物，如有機磷農藥，苯系物等，存在于各類廢水和受污染環境水體中，使得神經毒性成為水質毒性監測的重要指標之一。目前檢測和評估水體神經毒性的方式主要采用模式生物體內暴露法(in vivo)，即利用待測水樣對水生模式生物進行急性或慢性暴露后，檢測生物體內神經損傷指標(如乙酰膽堿酯酶)的變化，但此方法成本高、周期長、且無法進行水樣的批量檢測。此外，采用模式生物法只能對水樣的神經毒性進行定性評估，無法對其毒性大小進行定量表征，這在一定程度上阻礙了水樣毒性評估以及后續毒性削減工作朝定量化和標準化方向發展。而實現這一目標不僅需要開發適用于批量檢測水樣神經毒性的方法，還需建立一套適用于水樣神經毒性的定量評估體系。

近年來，體外試驗法(in vitro)由于與模式生物體內暴露實驗結果具有良好的相關性而越來越受到關注，其利用細胞或酶在體外環境中(培養皿或培養板)對樣品的反應進行毒性檢測，具有周期短、反應體積小、費用低等優點，適用于樣品數量較多時的批量檢測。

乙酰膽堿酯酶(AChE)是生物神經傳導中的一種關鍵性酶，在膽堿能突觸間，該酶能降解乙酰膽堿，終止神經遞質對突觸后膜的興奮作用，保證神經信號在生物體內的正常傳遞。通過檢測化學物在體外對乙酰膽堿酯酶的抑制率，可以在一定程度上表征受試化學物的神經毒性。這一理論為利用乙酰膽堿酯酶抑制性檢測水樣神經毒性提供了良好的理論基礎。但目前該技術領域主要利用乙酰膽堿酯酶對純化學品的毒性進行檢測，其操作方法不適用于水樣的處理，尤其當水樣含有痕量污染時，直接加樣使得樣品進一步稀釋，導致毒性結果無法檢出。目前，對于其在水樣神經毒性檢測方面的研究較少。此外，由于不同物種來源的乙酰膽堿酯酶對污染物敏感性有所差異，而水樣，尤其是廢水和受污染水體中污染物種類繁多，在評估其綜合神經毒性時需要考量不同物種間可能存在的差異，選取敏感物種進行評估。然而目前尚無完整的水樣神經毒性檢測與評估方法體系。

發明內容

1.要解決的問題

鑒于水質安全評估中水樣神經毒性的檢測和評估越來越受到關注，而傳統神經毒性檢測方法存在成本高、周期長、無法批量操作且缺乏毒性評估體系等問題，本發明提供一種乙酰膽堿酯酶體外試驗高通量檢測和評估水樣神經毒性的方法，不僅能在單次試驗中快速檢測多個水樣的神經毒性，而且能夠定量表征受試水樣的毒性大小和毒性等級。

2.技術方案

為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：

本發明提供了一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法，包括如下步驟：