[發明專利]一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法

在審

• 申請號: 202110647841.1
• 申請日: 2021-06-10
• 公開（公告）號: CN113390805A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 何席偉;張徐祥;周嘉偉;侯俊青
• 申請（專利權）人: 南京大學;南京大學宜興環保研究院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N33/535;G01N1/40
• 代理公司: 江蘇瑞途律師事務所 32346
• 代理人: 王琳琳;陳彬

1.一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)濃縮水樣中有機物，包括富集水樣中的有機物和濃縮富集的有機物，并記錄濃縮倍數；

(2)梯度稀釋樣品及毒性檢測參照化合物，包括將步驟(1)中濃縮后的有機物、毒性檢測參照化合物按比例梯度稀釋；

(3)乙酰膽堿酯酶反應，包括將步驟(2)中各稀釋梯度下的樣品、溶劑對照和參照化合物分別與電鰻乙酰膽堿酯酶、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)及碘化硫代乙酰膽堿進行反應，檢測各樣品、溶劑對照和參照化合物在415nm波長下的吸光度值；所述溶劑對照作為空白對照，對乙酰膽堿酯酶沒有抑制效果；

(4)計算水樣毒性當量，根據步驟(3)中檢測結果分別擬合參照化合物和樣品的劑量-效應曲線，計算水樣毒性當量；

(5)評估水樣毒性等級，根據步驟(4)中計算的水樣毒性當量評估水樣毒性等級。

2.根據權利要求1所述的一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法，其特征在于，所述水樣毒性當量的計算方式為：

(i)根據公式(1)計算各濃度下樣品和參照化合物的對電鰻乙酰膽堿酯酶的抑制率EC；

(ii)分別繪制樣品和參照化合物的劑量-效應曲線，得到EC50；

(iii)根據公式(2)計算樣品水樣毒性當量TEQ。

公式(1)

公式(2)

3.根據權利要求1或2所述的一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法，其特征在于，所述參照化合物為滅多威，所述毒性等級的評估體系為：

(i)TEQ0.2mg/L，其毒性等級為I級；

(ii)0.2mg/L≤TEQ0.02mg/L，其毒性等級為II級；

(iii)TEQ≤0.02mg/L，其毒性等級為III級。

4.根據權利要求3所述的一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法，其特征在于，步驟(3)中所述乙酰膽堿酯酶反應的加樣步驟包括：先分別添加各稀釋梯度下的樣品、溶劑對照和參照化合物，靜置至溶劑完全揮發；再依次加入電鰻乙酰膽堿酯酶、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，37℃靜置；最后加碘化硫代乙酰膽堿；室溫避光靜置10～15min后檢測吸光度。

5.根據權利要求4所述的一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法，其特征在于，步驟(3)中所述乙酰膽堿酯酶反應各物質的添加量為：相對于10μL的待測樣品，電鰻乙酰膽堿酯酶的量為0.005～0.015U；5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)的量為0.02～0.03mg；碘化硫代乙酰膽堿的量為0.02～0.03mg。

6.根據權利要求4或5所述的一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法，其特征在于，步驟(2)中所述濃縮后的有機物梯度稀釋包括將濃縮后的有機物按2～3倍的比例稀釋成4～6個濃度。

7.根據權利要求6所述的一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法，其特征在于，步驟(2)中所述參照化合物梯度稀釋包括將參照化合物按2～3倍比例稀釋10～12個濃度，稀釋的濃度范圍為1000～0.001mg/L。

8.根據權利要求7所述的一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的溶劑對照為甲醇；和/或步驟(1)中所述樣品濃縮后溶解于甲醇中。

9.根據權利要求8所述的一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的富集采用固相萃取或液-液萃取。

10.根據權利要求9所述的一種高通量快速檢測和評估水樣神經毒性的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的濃縮倍數為1000～5000倍，和/或濃縮采用氮吹方式。