[發(fā)明專利]一種大菱鲆肝實質(zhì)細(xì)胞系的建立方法及細(xì)胞系

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110645948.2
• 申請日: 2021-06-09
• 公開（公告）號: CN113215083B
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張文兵;潘明珠;劉家歡;李昕昕;楊夢曦;黃冬;郭衍林;羅凱;劉玥;麥康森
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/10;C12N15/85
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本發(fā)明涉及一種大菱鲆肝實質(zhì)細(xì)胞系的建立方法及細(xì)胞系，所述方法包括獲取大菱鲆的肝組織，將肝組織剪成組織塊并沖洗，采用四型膠原酶消化處理并再次沖洗，采用胰蛋白酶對消化處理后得到的組織塊再次消化處理，加入原代完全培養(yǎng)基終止消化，得到處理后的組織塊；將處理后的組織塊均勻的貼到培養(yǎng)瓶中，將貼好的培養(yǎng)瓶置于23攝氏度的培養(yǎng)箱中6h，再將培養(yǎng)瓶倒置6h，正置后加入4ml原代完全培養(yǎng)基中進(jìn)行原代培養(yǎng)再進(jìn)行傳代培養(yǎng)。通過本發(fā)明建立的大菱鲆肝實質(zhì)細(xì)胞系能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)傳代，從而提供大量的大菱鲆肝細(xì)胞；建立穩(wěn)定可持續(xù)的大菱鲆肝細(xì)胞系能夠?qū)⑵鋺?yīng)用于大菱鲆營養(yǎng)代謝的分子細(xì)胞生物學(xué)研究中，從而在細(xì)胞水平上彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大菱鲆肝實質(zhì)細(xì)胞系的建立方法及細(xì)胞系。

背景技術(shù)

肝臟是生物體內(nèi)最重要的器官之一，具有營養(yǎng)代謝和免疫調(diào)節(jié)等多種重要功能。在肝臟中，肝實質(zhì)細(xì)胞是肝臟中最主要的細(xì)胞類型，有著貯存糖原、蛋白代謝、脂肪代謝等重要的作用。在水產(chǎn)動物的研究中，魚類的肝臟被用于生長、免疫、毒性等實驗的研究。但由于水產(chǎn)動物個體差異性大，科學(xué)研究所得的數(shù)據(jù)往往組內(nèi)差異大，實驗結(jié)果與真實情況存在差異。因此，肝細(xì)胞培養(yǎng)在水產(chǎn)研究中的應(yīng)用越來越普遍。魚類的細(xì)胞系已經(jīng)在魚類營養(yǎng)學(xué)、毒理學(xué)、免疫學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)等研究領(lǐng)域做出了重要的貢獻(xiàn)。然而，目前水產(chǎn)動物細(xì)胞的培養(yǎng)多集中于原代培養(yǎng)，而細(xì)胞的原代培養(yǎng)與實驗所用水產(chǎn)動物的來源有著密切的關(guān)系。實驗重復(fù)性與水產(chǎn)動物的來源密不可分。因此，建立一種穩(wěn)定且可持續(xù)使用的肝細(xì)胞系對研究水產(chǎn)動物營養(yǎng)代謝、免疫調(diào)節(jié)與疾病防御有重要的意義。

大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)是一種具有高經(jīng)濟(jì)價值，肉質(zhì)鮮美，生長迅速的食肉魚類，大菱鲆在歐洲和亞洲都有大規(guī)模的養(yǎng)殖。相關(guān)技術(shù)中，目前在大菱鲆中已建立肌肉細(xì)胞系、鰭細(xì)胞系和腎細(xì)胞系等。大菱鲆肝細(xì)胞的培養(yǎng)在之前的研究中雖然有一定的進(jìn)展，但大菱鲆肝細(xì)胞系還沒有被建立，無法獲取可以連續(xù)傳代，且維持良好生長狀態(tài)的大菱鲆肝細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種大菱鲆肝實質(zhì)細(xì)胞系的建立方法及細(xì)胞系，以解決現(xiàn)有技術(shù)中無法獲取可以連續(xù)傳代，且維持良好生長狀態(tài)的大菱鲆肝細(xì)胞的問題。

為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種大菱鲆肝實質(zhì)細(xì)胞系的建立方法，包括：

獲取大菱鲆的肝組織，將所述肝組織剪成組織塊并沖洗，采用四型膠原酶消化處理并再次沖洗，采用胰蛋白酶對消化處理后得到的組織塊再次消化處理，加入原代完全培養(yǎng)基終止消化，得到處理后的組織塊；將處理后的組織塊均勻的貼到培養(yǎng)瓶中，將貼好的培養(yǎng)瓶置于23攝氏度的培養(yǎng)箱中6h，再將所述培養(yǎng)瓶倒置6h，正置后加入4ml原代完全培養(yǎng)基中進(jìn)行原代培養(yǎng)；

在原代培養(yǎng)過程中，每三天更換一次原代完全培養(yǎng)基，當(dāng)遷出的細(xì)胞融合并長成細(xì)胞單層時進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

在傳代培養(yǎng)過程中，去除原代完全培養(yǎng)基后，加入含1ml EDTA的胰蛋白酶，輕輕搖晃使胰蛋白酶鋪滿培養(yǎng)瓶底，之后將胰蛋白酶吸出，再加入1ml胰蛋白酶，放入培養(yǎng)箱靜置3min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞收縮的情況，當(dāng)細(xì)胞變圓且未懸浮之前，將胰蛋白酶吸出，拍打瓶底使細(xì)胞脫落，后加入8ml原代完全培養(yǎng)基混勻，分別吸入4ml到新的培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)瓶上標(biāo)記好傳代的時間和傳代的代數(shù)。當(dāng)傳代超過15代之后，將原代完全培養(yǎng)基換成傳代完全培養(yǎng)基。

進(jìn)一步的，還包括：

對培養(yǎng)的肝細(xì)胞進(jìn)行PAS染色鑒定是否是肝實質(zhì)細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述對培養(yǎng)的肝細(xì)胞進(jìn)行PAS染色鑒定是否是肝實質(zhì)細(xì)胞，包括：

如果肝細(xì)胞胞質(zhì)被染成紫紅色，則證明肝細(xì)胞為肝實質(zhì)細(xì)胞；

如果肝細(xì)胞胞質(zhì)未被染成紫紅色，則證明肝細(xì)胞為肝纖維細(xì)胞。

進(jìn)一步的，還包括：