[發明專利]一種大菱鲆肝實質細胞系的建立方法及細胞系

有效

• 申請號: 202110645948.2
• 申請日: 2021-06-09
• 公開（公告）號: CN113215083B
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發明（設計）人: 張文兵;潘明珠;劉家歡;李昕昕;楊夢曦;黃冬;郭衍林;羅凱;劉玥;麥康森
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種大菱鲆肝實質細胞系的建立方法，其特征在于，包括：

獲取大菱鲆的肝組織，將所述肝組織剪成組織塊并沖洗，采用四型膠原酶消化處理并再次沖洗，采用胰蛋白酶對消化處理后得到的組織塊再次消化處理，加入原代完全培養基終止消化，得到處理后的組織塊；將處理后的組織塊均勻的貼到培養瓶中，將貼好的培養瓶置于23攝氏度的培養箱中6h，再將所述培養瓶倒置6h，正置后加入4ml原代完全培養基中進行原代培養；

在原代培養過程中，每三天更換一次原代完全培養基，當遷出的細胞融合并長成細胞單層時進行傳代培養；

在傳代培養過程中，去除原代完全培養基后，加入含1ml EDTA的胰蛋白酶，輕輕搖晃使胰蛋白酶鋪滿培養瓶底，之后將胰蛋白酶吸出，再加入1ml胰蛋白酶，放入培養箱靜置3min，在顯微鏡下觀察細胞收縮的情況，當細胞變圓且未懸浮之前，將胰蛋白酶吸出，拍打瓶底使細胞脫落，后加入8ml原代完全培養基混勻，分別吸入4ml到新的培養瓶中，在培養瓶上標記好傳代的時間和傳代的代數，當傳代超過15代之后，將原代完全培養基換成傳代完全培養基；

基礎培養基包括：每100ml DMEM/F12培養基中，加入1ml青霉素鏈霉素混合液100×；

原代完全培養基包括：每100ml DMEM/F12培養基中，20％的胎牛血清，10μg/L EGF，10μg/L FGF，10μg/L HGF，配制好的的培養基用0.22μm濾膜過濾除菌；

傳代完全培養基包括：每100ml DMEM/F12培養基中，10％的胎牛血清，配制好的的培養基用0.22μm濾膜過濾除菌；

所述獲取大菱鲆的肝組織，將所述肝組織剪成組織塊并沖洗，采用四型膠原酶消化處理并再次沖洗，包括：

將肝組織剪成1mm³的組織塊，用含有雙抗的D-PBS沖洗兩遍；室溫下，在15ml離心管中用0.1％的四型膠原酶消化30min，消化的同時用旋轉振蕩器進行旋轉震蕩，使肝組織充分接觸膠原酶；用含有雙抗的D-PBS沖洗一遍；

所述采用胰蛋白酶對消化處理后得到的組織塊再次消化處理，加入原代完全培養基終止消化，得到處理后的組織塊，包括：

室溫下，在15ml離心管中用0.25％含EDTA的胰蛋白酶對消化處理后得到的組織塊消化5min，加入原代完全培養基終止消化。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括：

對培養的肝細胞進行PAS染色鑒定是否是肝實質細胞。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述對培養的肝細胞進行PAS染色鑒定是否是肝實質細胞，包括：

如果肝細胞胞質被染成紫紅色，則證明肝細胞為肝實質細胞；

如果肝細胞胞質未被染成紫紅色，則證明肝細胞為肝纖維細胞。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括：

對傳代培養超過30代的肝細胞進行染色體核型分析，以檢測大菱鲆肝細胞傳代的過程中是否出現變異。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括：

對傳代培養超過25代的肝細胞進行細胞活性檢測。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括：

將肝細胞接入六孔板中，采用pcDNA3.1-egfp轉染肝細胞，在六孔板的每個孔中加入5μg質粒，24h后，在熒光顯微鏡下觀察轉染效果。

7.一種細胞系，其特征在于，采用如權利要求1至6任一項所述的大菱鲆肝實質細胞系的建立方法建立。