[發(fā)明專利]融合基因突變的熒光定量PCR檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110642037.4
• 申請日: 2021-06-09
• 公開（公告）號: CN113136419A
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝洪濤;羅偉全;王勇斯;溫韻潔;陳丹;余沁涵
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州華銀健康醫(yī)療集團(tuán)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 廣州瑞之凡知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44514
• 代理人: 黃愛君

本發(fā)明公開了融合基因突變的熒光定量PCR檢測方法，包括如下步驟：1)融合基因位點(diǎn)查找；2)融合突變序列兼并分析；3)擴(kuò)增引物的設(shè)計與合成；4)反應(yīng)體系的擴(kuò)增與驗(yàn)證。本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供的融合基因突變的熒光定量PCR檢測方法，可以針對不同融合基因設(shè)計相應(yīng)的引物，并實(shí)現(xiàn)其融合基因突變的檢測，提高檢測效率和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及融合基因突變的熒光定量PCR檢測方法。

背景技術(shù)

融合基因，是指將兩個或多個基因的編碼區(qū)首尾相連，置于同一套調(diào)控序列(包括啟動子、增強(qiáng)子和核糖體結(jié)合序列等)控制之下，構(gòu)成的嵌合基因。融合基因的表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白，融合基因突變可導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平、功能和作用位點(diǎn)的異常，容易導(dǎo)致或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

針對融合基因突變的檢測方法主要包括：免疫組化法(IHC)、熒光原位雜交(FISH)和高通量測序法(High-throughput sequencing)。免疫組化法是一種以組織為基礎(chǔ)的蛋白檢測方法，發(fā)生基因融合的腫瘤細(xì)胞存在明顯的膜著色反應(yīng)，操作較簡便，但檢測結(jié)果容易受影響，結(jié)果判定存在主觀判斷的差異，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性。熒光原位雜交法(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，通過特殊手段使帶有熒光物質(zhì)的探針與目標(biāo)DNA接合，最后用熒光顯微鏡即可直接觀察目標(biāo)DNA所在的位置；該方法的檢測靈敏度較高，但操作較復(fù)雜，需要在載體上進(jìn)行平面讀取，缺乏立體空間讀取功能，可能存在空間折疊導(dǎo)致誤判，并且需要人工判讀，受限于人工判讀的經(jīng)驗(yàn)及復(fù)雜度等方面，判讀存在技術(shù)要求高、判讀結(jié)果容易存在偏差等問題，且對檢測樣本保存的要求較高，容易因保持時間過長導(dǎo)致假陰性的發(fā)生，在臨床檢測中受到一定的限制。高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing)以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志，對相關(guān)軟件的要求較高，測序成本較高，操作繁瑣，測序數(shù)據(jù)讀取時間較長，對于低頻突變檢出結(jié)果準(zhǔn)確性、時效性不足，尚難以在臨床檢測中得到廣泛的應(yīng)用。

EML4和ALK兩個基因分別位于人類2號染色體的p21和p23帶，相隔約10Mb左右的距離。這兩個基因片段的倒位融合能夠使得組織表達(dá)新的融合蛋白。不同的EML4-ALK融合突變體往往具有惡性轉(zhuǎn)化和致瘤性能力，然而，對EMI4-ALK融合基因突變的檢測方法還有待提高其檢出的特異性和敏感性。

熒光定量PCR檢測技術(shù)是美國PE公司研發(fā)的一種新的核酸定量技術(shù)，在基因表達(dá)差異分析、SNP檢測、產(chǎn)前診斷和藥物療效考核等方面得到廣泛的應(yīng)用，但尚未在融合基因檢測方面得到廣泛應(yīng)用，因此，提供融合基因突變的熒光定量PCR檢測方法，提高檢測效率和檢測結(jié)果，具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種融合基因突變的熒光定量PCR檢測方法，提高檢測效率和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明可以針對不同融合基因設(shè)計相應(yīng)的引物，并實(shí)現(xiàn)其融合基因突變的檢測。

本發(fā)明的目的將通過下面的詳細(xì)描述來進(jìn)一步說明。

本發(fā)明提供融合基因突變的熒光定量PCR檢測方法，包括如下步驟：

1)融合基因位點(diǎn)查找：查找融合基因信息，查找其外顯子斷裂點(diǎn)，并根據(jù)外顯子斷裂點(diǎn)查找其斷裂點(diǎn)到終止點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本序列；

2)融合突變序列兼并分析：將步驟1)得到的兩段轉(zhuǎn)錄本序列合并，作為完整的融合結(jié)果序列；

3)擴(kuò)增引物的設(shè)計與合成：以步驟2)得到的融合結(jié)果序列為序列模板，進(jìn)行上下游擴(kuò)增引物的序列設(shè)計，合成并純化；