[發明專利]一株產熱穩定和pH穩定細菌素的乳酸乳球菌及其篩選方法和應用

在審

• 申請號: 202110641135.6
• 申請日: 2021-06-09
• 公開（公告）號: CN113403228A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 熊濤;彭珍;許曉燕
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12P21/00;C07K14/195;C12R1/01
• 代理公司: 南昌金軒知識產權代理有限公司 36129
• 代理人: 余鵬錦

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一株產熱穩定和pH穩定細菌素的乳酸乳球菌及其篩選方法和應用。本發明乳酸乳球菌篩選自自然發酵的泡菜，命名為NCU036018，其16S rRNA序列SEQ ID：1所示，保藏編號為CGMCCNo.22077。本發明的乳酸乳球菌NCU036018產生的細菌素安全、無味、可生物降解、在pH 2?10范圍內能夠同時抑制鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，且在pH中性條件下經高溫處理抑菌活性依然顯著，相對于傳統的化學、生物防腐劑(Nisin)更有優勢，可廣泛運用于發酵制品的制備和保藏。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一株產熱穩定和pH穩定細菌素的乳酸乳球菌及其篩選方法和應用。

背景技術

植物基發酵制品在制備和保藏過程中，多種潛在因素可導致染菌而引起食物中毒。金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌是常見的食源性致病菌。其中，鼠傷寒沙門氏菌是引起急性胃腸炎的主要病原菌之一，若未及時治療將引起敗血癥，即細菌侵入血液循環并在血中生長繁殖，產生毒素而引發急性全身性感染。在國標中制定了沙門氏菌的限量標準，規定肉制品、水產制品、糧食制品等所有11類食品，按照二級采樣方案同批次采集5份樣品，在被檢的5份樣品中，不允許任一樣品檢出沙門氏菌；金黃色葡萄球菌能夠產生腸毒素引起食物中毒，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25％左右，金黃色葡萄球菌成為排名第三的微生物致病菌，對人體腸道產生破壞導致嘔吐腹瀉等癥狀。在國標中制定了金黃色葡萄球菌的限量標準，規定肉制品、水產制品、糧食制品、即食豆類制品、即食果蔬制品、飲料、冷凍飲品及即食調味品等8類食品，按照三級采樣方案同批次采集5份樣品，每份樣品中的金黃色葡萄球菌濃度均不得超出1000CFU/g(mL)，僅允許其中1份樣品在100-1000 CFU/g(mL)之間。

目前植物基發酵制品主要依賴傳統的苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀和乳酸鏈球菌素(Nisin)等防腐劑來抑制此類食源性病原菌。然而，由于苯甲酸、苯甲酸鈉和山梨酸鉀呈味、具低毒性，以及Nisin在pH中性條件下不耐熱而使其使用受到限制。

發明內容

本發明的目的是提供一株產熱穩定和pH穩定細菌素的乳酸乳球菌(L. lactis)及其篩選方法和應用，該菌為NCU036018，其產生的細菌素能夠在pH 2-10范圍內同時抑制鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，且在pH中性條件下經高溫處理抑菌活性依然顯著，相對于傳統的化學、生物防腐劑(Nisin)更有優勢，可廣泛運用于發酵制品的制備和保藏。

本發明提供一株產熱穩定和pH穩定細菌素的乳酸乳球菌，該乳酸乳球菌篩選自自然發酵的泡菜，菌株為NCU036018，其16S rRNA序列如SEQ ID：1 所示，該乳酸乳球菌菌株已于2021年3月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.22077，分類命名為乳酸乳球菌Lactobacillus lactis。

本發明還提供一株產熱穩定和pH穩定細菌素的乳酸乳球菌的篩選方法，包括如下步驟：

((1)培養：取泡菜樣品液1mL用生理鹽水進行梯度稀釋，選取合適濃度梯度，涂布于MRS固體培養基上，37℃倒置培養46-50h；

(2)純化：挑取步驟(2)培養基上具有不同形態的單菌落進行連續劃線純化培養；

(3)保存：挑取步驟(3)純化好的單菌落于10mL MRS液體培養基中孵育22-25h，分別取培養液和50％的滅菌甘油各500μL按1:1(v/v)混合并保存于-80℃冰箱；

(4)活化：將步驟(3)分離保存的菌株接種到MRS液體培養基中，37℃活化22-25h，再以2％的接種量接種到MRS液體培養基中，37℃恒溫培養22-25 h得到乳酸菌發酵液；