[發明專利]一種鈣離子拮抗劑代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應用

在審

• 申請號: 202110640131.6
• 申請日: 2021-06-09
• 公開（公告）號: CN113549686A
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發明（設計）人: 劉丹;易倩春
• 申請（專利權）人: 湖南菲思特精準醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869
• 代理公司: 湖南喬熹知識產權代理事務所(普通合伙) 43262
• 代理人: 安曼

本發明公開了一種鈣離子拮抗劑代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應用，其中，所述試劑盒包括如下組分：CYP3A5*3擴增引物、CYP3A5*3測序引物、NPPA(T2238C)擴增引物、NPPA(T2238C)測序引物和陽性對照。本發明通過多重RPA一管擴增CYP3A5*3、NPPA(T2238C)，快速、有效地在恒定溫度下產生大量擴增產物。通過直接與羧基修飾素結合的氨基標記單鏈DNA特異捕獲單鏈DNA，洗滌后加入測序引物和測序原料，進行焦磷酸測序，減少了強堿性試劑對擴增片段的損傷，簡化了測序處理的流程和時間。

技術領域

本發明涉及一種鈣離子拮抗劑代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應用，屬于基因檢測領域。

背景技術

目前臨床常用的抗高血壓藥物有5大類：利尿劑、血管緊張素轉化酶抑制劑、血管緊張素受體阻滯劑、β受體阻滯劑、鈣離子拮抗劑。藥物在體內代謝過程中涉及到多種藥物代謝酶、轉運體和受體，它們存在的基因多態性最終導致了患者以相同方式服用同種藥物時，其治療效果、產生的不良發展及其對藥物的耐受性等方面存在明顯的個體差異。

鈣離子拮抗劑是通過阻滯鈣通道來降低血壓的化學制劑。它可以選擇性抑制 Ca2+經細胞膜上的鈣通道進入細胞內，具有擴張血管和負性肌力作用，松弛血管平滑肌，減少末梢血管阻力，從而降低血壓，但腦、冠狀動脈和腎血流量不減少。硝苯地平、氨氯地平是常用的治療高血壓的鈣離子拮抗劑。研究表明，NPPA基因 T2238C多態性會影響利尿劑和鈣離子拮抗劑的藥物療效。但是該基因在中國人群中突變頻率較低。據報道，中國人群中CACNA1C基因的的rs2238032G/T位點GG型患者4周末收縮壓和舒張壓降幅均顯著低于TT或GT型△SBP4.0±11.6mmHg vs.19.9±14.1mmHg，p＝0.007；△DBP﹣2.2±4.5mmHg vs.9.9±8.9mmHg，p＝0.005)， GG型患者增加氨氯地平服藥劑量或者加用其它降壓藥物才能使血壓達標。

CYP3A家族是人體內介導藥物代謝最多的藥物代謝酶，50％以上臨床常用藥物的氧化、還原反應都通過CYP3A4和CYP3A5催化來完成。鈣離子拮抗劑主要通過 CYP3A5酶代謝。CYP3A5的表達與活性呈高度多態性，存在廣泛的個體及種族間差異。其中CYP3A5*3(A6986G，intron3)基因型較常見，中國人約65％～73％。CYP3A5 的基因突變是酶活性產生差異的主要原因，CYP3A5突變使其酶活性顯著下降，底物藥物代謝減緩，藥物作用及毒副反應明顯增加。研究表明，CYP3A5*3基因型降低了氨氯地平清除率，增加了降壓療效。

目前，對于基因多態性檢測的方法有很多種，如直接測序法、芯片法、高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性擴增法、taqman熒光探針法等。其中，測序法和芯片法，操作步驟繁瑣，檢測周期長，且擴增產物容易產生污染；高分辨率熔解曲線法步驟簡單，特異性偏低，且對儀器設備的要求較高；等位基因特異性擴增法采用 ARMS引物進行特異擴增，其引物設計難以最優化，檢測條件要求嚴格。Taqman熒光探針法其試驗成本高，對于多個基因的擴增通量不高。因此，需要建立一種簡單、快速有效、價格低廉、特異性高的檢測基因多態性的方法。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的是以多重RPA擴增和優化焦磷酸測序技術為基礎，獲得一種鈣離子拮抗劑代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應用。

為實現上述發明目的之一，本發明采用的鈣離子拮抗劑代謝標志物的檢測試劑盒的技術方案如下：

本發明的檢測試劑盒針對CYP3A5*3、NPPA(T2238C)兩個基因的多態性設計特異性擴增引物和測序引物，所述試劑盒包括如下組分：擴增試劑1、擴增試劑2、CYP3A5*3測序引物、NPPA(T2238C)測序引物、陽性對照。

優選地，所述設計特異性引物，如下表所示：