[發(fā)明專利]一種塞來昔布代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用

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• 申請日: 2021-06-09
• 公開（公告）號: CN113549685A
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳立波;劉丹
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南菲思特精準醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869
• 代理公司: 湖南喬熹知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43262
• 代理人: 安曼

本發(fā)明公開了一種塞來昔布代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用，其中，所述檢測試劑盒檢測塞來昔布代謝標志物基因位點CYP2C9*3的基因多態(tài)性，所述試劑盒包括CYP2C9*3擴增引物、CYP2C9*3測序引物和陽性對照。本發(fā)明以RPA擴增和優(yōu)化焦磷酸測序技術(shù)為組合對塞來昔布不良反應(yīng)相關(guān)的基因多態(tài)性進行檢測，試劑盒可同時檢測CYP2C9*3基因多態(tài)性塞來昔布不良反應(yīng)預(yù)測，為臨床個性化用藥給出基因角度的建議。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種塞來昔布代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用，屬于基因檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

塞來昔布是昔布類非甾體類抗炎藥，通過特異性抑制環(huán)氧酶-2而發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用，其不良反應(yīng)涉及心血管系統(tǒng)、胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，如引起高血壓、消化不良、頭疼等。塞來昔布在肝臟中主要由CYP2C9代謝。建議攜帶CYP2C9低酶活性基因型的患者降低塞來昔布的用藥劑量，從而降低藥物不良反應(yīng)的發(fā)生風險。

細胞色素氧化酶P450主要存在于肝臟、腸道，在藥物代謝中占有重要地位。CYP2C9是細胞色素氧化酶P450家族的重要成員，占肝微粒體P450蛋白總量的20％。該基因位于10q24，編碼的蛋白能羥化代謝許多不同性質(zhì)的藥物，主要是酸性底物。CYP2C9參與抗凝血藥、抗驚厥藥、降糖藥、非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥、抗高血壓藥以及利尿藥等多種藥物的羥化代謝，其中華法林、甲苯磺丁脲和苯妥因均為治療指數(shù)較窄的藥物。CYP2C9活性變化可導(dǎo)致這些藥物體內(nèi)濃度出現(xiàn)較大變化，甚至導(dǎo)致嚴重藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。 CYP2C9*3(A1075C，Ile359Leu)導(dǎo)致CYP2C9酶活性降低，CYP2C9*3純合子個體酶活性僅為該位點野生型純合子基因型個體(攜帶CYP2C9*1或Arg144/Ile359等位基因)的 4～6％。CYPC2C9*3的頻率為3％。CYP2C9遺傳多態(tài)性導(dǎo)致其酶活性變化，從而導(dǎo)致藥物代謝種族和個體差異現(xiàn)象。

目前，對于基因多態(tài)性檢測的方法有很多種，如直接測序法、芯片法、高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性擴增法、taqman熒光探針法等。其中，測序法和芯片法，操作步驟繁瑣，檢測周期長，且擴增產(chǎn)物容易產(chǎn)生污染；高分辨率熔解曲線法步驟簡單，特異性偏低，且對儀器設(shè)備的要求較高；等位基因特異性擴增法采用ARMS引物進行特異擴增，其引物設(shè)計難以最優(yōu)化，檢測條件要求嚴格。Taqman熒光探針法其試驗成本高，對于多個基因的擴增通量不高。因此，需要建立一種簡單、快速有效、價格低廉、特異性高的檢測基因多態(tài)性的方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是以RPA擴增和焦磷酸測序技術(shù)為基礎(chǔ)，獲得一種塞來昔布代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的之一，本發(fā)明采用的塞來昔布代謝標志物的檢測試劑盒的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的試劑盒針對CYP2C9*3基因的多態(tài)性設(shè)計特異性擴增引物和測序引物，所述試劑盒包括如下組分：擴增反應(yīng)液、CYP2C9*3測序引物、陽性對照。

優(yōu)選地，所述設(shè)計特異性引物，如下表所示：

優(yōu)選的，所述CYP2C9*3的特異性引物組序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示。

優(yōu)選的，所述的CYP2C9*3測序引物如序列表SEQ ID NO:3所示。

更優(yōu)選的，所述的測序引物，為核酸類似物，其骨架為肽鍵而非磷酸二酯鍵，肽鍵骨架連有相應(yīng)的堿基。該結(jié)構(gòu)具有生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無論蛋白酶還是核酸酶都不易將其降解。

更優(yōu)選的，所述的測序引物，為瓊脂糖凝膠顆粒與氨基標記的PNA序列的結(jié)合物，該結(jié)合物與DNA結(jié)合較DNA/DNA的結(jié)合更為穩(wěn)定且特異性高于DNA/DNA的捕獲，且不受鹽離子濃度的影響。可既充當測序引物又作為捕獲探針，與擴增的產(chǎn)物結(jié)合以后，經(jīng)過簡單洗滌即可直接用于測序反應(yīng)。