[發明專利]一種硝酸甘油代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應用

在審

• 申請號: 202110639835.1
• 申請日: 2021-06-09
• 公開（公告）號: CN113584143A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 陳立波;劉丹
• 申請（專利權）人: 湖南菲思特精準醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6844;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 湖南喬熹知識產權代理事務所(普通合伙) 43262
• 代理人: 安曼

本發明公開了一種硝酸甘油代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應用，其中，檢測試劑盒用于檢測硝酸甘油的代謝標志物基因位點ALDH2G1510A的基因多態性，試劑盒包括ALDH2G1510A擴增引物、ALDH2G1510A測序引物和陽性對照。本發明通過RPA擴增ALDH2(G1510A)，快速、有效地在恒定溫度下產生大量擴增產物，通過直接與羧基修飾素結合的氨基標記單鏈DNA類似物特異捕獲單鏈DNA，洗滌后，加入測序引物與模板DNA退火后，加入測序原料進行焦磷酸測序。

技術領域

本發明涉及一種硝酸甘油代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應用，屬于基因檢測領域。

背景技術

硝酸甘油是心絞痛和急性心肌梗死的一線治療藥物，能夠有效緩解心絞痛的癥狀。中國人含服硝酸甘油無效比例高達25％，硝酸甘油的臨床有效性常因人而異，有些患者出現心絞痛時服用硝酸甘油會出現用藥無效現象，或者是過半小時以上才有效。研究表明ALDH2基因突變是影響硝酸甘油療效的決定性因素。ALDH2基因，位于人類第12號染色體，ALDH2同時具有乙醛脫氫酶和酯酶活性，參與乙醇、硝酸甘油等藥物的代謝。ALDH2 代謝活化硝酸甘油成其活性代謝產物一氧化氮，硝酸甘油的舒血管作用是通過釋放一氧化氮所介導，而ALDH2是一氧化氮形成的關鍵。ALDH2*2(Glu504Lys，rs671)多態導致所編碼蛋白質504位谷氨酸被賴氨酸所取代，攜帶突變等位基因(ALDH2*2)的個體ALDH2 酶活性下降，雜合子個體酶活性僅為野生型個體的10％，突變純合子個體酶活性缺失。因此，攜帶ALDH2*2等位基因的個體酒精代謝能力下降，少量飲酒即出現臉紅、心跳加速等不適；代謝硝酸甘油的能力下降，硝酸甘油抗心肌缺血的效應減弱。如果病人基因中攜帶 ALDH2突變，硝酸酯酶活性會降低10倍以上，使硝酸甘油難以發揮藥效。因此，攜帶 ALDH2*2等位基因的個體酒精代謝能力下降，少量飲酒即出現臉紅、心跳加速等不適；代謝硝酸甘油的能力下降，硝酸甘油抗心肌缺血的效應減弱。亞洲人群中ALDH2*2等位基因的攜帶率為30～50％。攜帶ALDH2*2等位基因的心絞痛患者應盡可能改用其他急救藥物，避免硝酸甘油含服無效。

目前，對于基因多態性檢測的方法有很多種，如直接測序法、芯片法、高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性擴增法、taqman熒光探針法等。其中，測序法和芯片法，操作步驟繁瑣，檢測周期長，且擴增產物容易產生污染；高分辨率熔解曲線法步驟簡單，特異性偏低，且對儀器設備的要求較高；等位基因特異性擴增法采用ARMS引物進行特異擴增，其引物設計難以最優化，檢測條件要求嚴格。Taqman熒光探針法其試驗成本高，對于多個基因的擴增通量不高。因此，需要建立一種簡單、快速有效、價格低廉、特異性高的檢測基因多態性的方法。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的是以RPA擴增和焦磷酸測序技術為基礎，獲得一種硝酸甘油代謝標志物的檢測試劑盒及其檢測方法和應用。

為實現上述發明目的之一，本發明采用的硝酸甘油代謝標志物的檢測試劑盒的技術方案如下：

本發明的檢測試劑盒用于檢測硝酸甘油的代謝標志物基因位點ALDH2 G1510A的基因多態性，試劑盒包括ALDH2 G1510A擴增引物、ALDH2 G1510A測序引物和陽性對照，針試劑盒對ALDH2(G1510A)基因的多態性設計特異性擴增引物和測序引物，所述試劑盒包括如下組分：擴增反應液、ALDH2(G1510A)測序引物、陽性對照。

優選地，所述設計特異性引物，如下表所示：

優選的，所述ALDH2(G1510A)的特異性引物組序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:2所示。

優選的，所述的ALDH2(G1510A)測序引物如序列表SEQ ID NO:3所示。

更優選的，所述的測序引物，為核酸類似物，其骨架為肽鍵而非磷酸二酯鍵，肽鍵骨架連有相應的堿基。該結構具有生物學性質穩定，無論蛋白酶還是核酸酶都不易將其降解。