[發明專利]一種用于香蕉枯萎病菌milRNA檢測的內參基因及其應用

有效

• 申請號: 202110632523.8
• 申請日: 2021-06-07
• 公開（公告）號: CN113234804B
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發明（設計）人: 李敏慧;畢蕓田;曾敬;鐘家祺;孔廣輝;李華平;姜子德
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/113;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

本發明公開了一種用于香蕉枯萎病菌milRNA檢測的內參基因及其應用，屬于生物技術領域。所述內參基因命名為milR46，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明提供的內參基因使得香蕉枯萎病菌病菌milRNAs標準化過程的準確度獲得了極大地提高，適用于接種后不同時間段milRNA的檢測，穩定性高，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于香蕉枯萎病菌milRNA檢測的內參基因及其應用。

背景技術

香蕉枯萎病(Banana Fusarium wilt)，又稱巴拿馬病或黃葉病，是由尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，Foc)引起的一種土傳維管束病害。該病害一般在香蕉生長接近抽蕾的中后期呈現明顯的外部癥狀。病株出現葉片黃化凋萎，維管束變褐，最終整株死亡的現象。目前，世界范圍內蔓延最廣、危害最重的香蕉枯萎病菌是熱帶4號生理小種TR4(Tropical Race 4)。

microRNA(miRNA)是一種非編碼單鏈小分子RNA，長度約為19～24個核苷酸，是在真核生物體內產生的。真菌中也發現一種小分子RNA，其前體具有典型的莖環結構，與動植物中的miRNA類似，因此被稱為miRNA like small RNA(milRNA)，已被證實在植物病原真菌致病過程中發揮著重要的調控作用。

實時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)方法通過熒光強度的積累實時反應PCR進程，對起始模板進行定量分析，該方法具有靈敏度高、特異性高、精確性高和信息豐富的優點，已被廣泛應用于分子生物學、醫學、食品檢測和環境監測等多個研究與應用領域。而在眾多影響該實驗結果準確度的因素中，用來標準化實驗結果的內參基因的選擇是保證實驗結果準確的前提和關鍵。然而，由于受內外環境的影響，在細胞中真正恒定表達的基因并不存在，所以需要根據試驗對象和試驗條件篩選內參基因。

迄今為止，標準化測量樣本中miRNA時，對參照基因的選擇都還停留于經驗。一些內源性基因常被用作組織/細胞miRNA檢測的內參基因，比如5SrRNA、18SrRNA、snRNA(U4和U6)等，但是由于這些基因不是miRNA，不能代表miRNA，而且這些基因的提取、反轉錄和PCR擴增的效率可能與miRNA有所不同。因此，這些基因也不是最理想的選擇。

因此，選取穩定、合適、適應性更廣的內參基因對準確分析香蕉枯萎病菌milRNA基因熒光定量PCR結果有較大意義。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種用于香蕉枯萎病菌milRNA檢測的內參基因。

本發明的另一目的在于提供上述用于香蕉枯萎病菌milRNA檢測的內參基因的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種用于香蕉枯萎病菌milRNA檢測的內參基因，所述的內參基因命名為milR46，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述用于香蕉枯萎病菌milRNA檢測的內參基因的前體，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

特異性擴增上述用于香蕉枯萎病菌milRNA檢測的內參基因的引物。

在所述的引物中，正向引物的序列如SEQ ID NO.7所示。

一種用于香蕉枯萎病菌milRNA檢測的PCR試劑盒，包含上述引物。

所述試劑盒還含有PCR反應緩沖液、DNA聚合酶、dNTP中的一種或多種。

上述用于香蕉枯萎病菌milRNA檢測的內參基因或其前體，或特異性擴增上述用于香蕉枯萎病菌milRNA檢測的內參基因的引物，或上述用于香蕉枯萎病菌milRNA檢測的PCR試劑盒，在香蕉枯萎病病菌基因表達分析或研究中的應用。