[發(fā)明專利]基于非病毒載體的CD133特異性且自分泌PD1 scFv的CAR-T細胞的制備方法

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• 申請日: 2021-06-07
• 公開（公告）號: CN113684226A
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發(fā)明（設計）人: 夏建川;楊朝聘
• 申請（專利權(quán)）人: 夏建川
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/64;C12N15/62;C12N5/10
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 劉孟斌

本發(fā)明公開了一種基于非病毒載體的CD133特異性且自分泌PD1scFv的CAR?T細胞的制備方法。本發(fā)明所述的制備方法包括：睡美人CAR微環(huán)母體質(zhì)粒和睡美人轉(zhuǎn)座酶微環(huán)母體質(zhì)粒的構(gòu)建；睡美人CAR微環(huán)質(zhì)粒和睡美人轉(zhuǎn)座酶微環(huán)質(zhì)粒的制備；電轉(zhuǎn)制備CAR?T細胞；擴增富集CAR?T細胞；以及CAR?T細胞收獲和鑒定。本發(fā)明通過非病毒方法得到分泌PD1scFv且靶向CD133的CAR?T細胞，該細胞不僅能有效地將CAR?T細胞和免疫檢查點抑制劑的優(yōu)勢聯(lián)合起來，且采用的非病毒睡美人轉(zhuǎn)座子聯(lián)合微環(huán)的方法，還能進一步去除質(zhì)粒上的抗性基因，能最大程度保證CAR?T細胞在臨床應用的安全性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域，涉及一種非病毒載體的CD133特異性且自分泌PD1單鏈抗體scFv的CAR-T細胞的制備方法，具體涉及一種基于睡美人轉(zhuǎn)座子和微環(huán)載體技術(shù)構(gòu)建非病毒CAR-T細胞的方法。

背景技術(shù)

原發(fā)性肝癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療仍難有效治療腫瘤，迫切需要開發(fā)新的治療手段，免疫治療已成為當前腫瘤治療研究和臨床應用的熱點。其中，通過基因工程手段在體外修飾T細胞后再回輸至患者體內(nèi)的CAR-T細胞療法，在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤中展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢，但其在實體瘤中的治療效果不佳，因此有必要研究如何改進CAR-T細胞的功能，使之能在實體瘤中得到更好的應用。

CD133是一種跨膜糖蛋白，有研究報道，CD133在中晚期肝癌中表達，除此之外，CD133還是腫瘤干細胞和內(nèi)皮祖細胞的標志，常常伴隨著腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)，這些特征使CD133成為CAR-T細胞合理的靶點。免疫檢查點抑制劑如PD1單抗，能通過解除T細胞表面PD1抑制性受體的信號，恢復T細胞對腫瘤的殺傷能力，在多種實體瘤中延長患者的生存時間。因此，CAR-T細胞和免疫抑制點療法給攻克腫瘤帶來了很多希望，而構(gòu)建一種能分泌PD1scFv且靶向腫瘤的CAR-T細胞能有效將這兩種技術(shù)有機結(jié)合在一起，有望為治療實體瘤提供一種新的策略。然而，在制備能分泌PD1 scFv的CAR-T細胞的過程中仍有很多亟需解決的問題，如目前大多數(shù)CAR-T細胞是基于慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建的，基于病毒的方法能保證CAR-T細胞的高轉(zhuǎn)染效率，但是病毒載體的制備過程復雜，成本昂貴。此外，病毒載體潛在地能引起插入突變、致瘤性，并且在載體效力、安全性評估以及運輸上都存在挑戰(zhàn)。

免疫檢查點抑制劑如PD1抗體在臨床上也取得了很好的療效，但其價格昂貴，且患者需要多次回輸，PD1抗體常通過靜脈給藥，難以精準靶向腫瘤。同時，PD1抗體在體內(nèi)非腫瘤組織的富集也會降低PD-1抗體的作用并引起一定的副作用。因此，研發(fā)一種快速、安全的非病毒基因遞送系統(tǒng)，并通過該方法構(gòu)建出能分泌PD1 scFv的CAR-T細胞有望同時發(fā)揮細胞治療和免疫抑制點治療的優(yōu)點，為中晚期肝癌的治療提供一種新策略具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于非病毒載體的CD133特異性且自分泌PD1scFv的CAR-T細胞的制備方法，該方法能解決目前用病毒制備CAR-T細胞和質(zhì)粒修飾T細胞常帶有抗性基因等安全性不足的問題，通過聯(lián)合睡美人轉(zhuǎn)座子和微環(huán)載體技術(shù)實現(xiàn)CAR基因?qū)細胞的穩(wěn)定整合，同時也避免了質(zhì)?？剐曰蛟谌梭w應用中的潛在風險。

本發(fā)明所述的基于非病毒載體的CD133特異性且自分泌PD1 scFv的CAR-T細胞的制備方法，是通過非病毒方法構(gòu)建一種能自分泌PD1 scFv且靶向CD133的CAR-T細胞，包括以下步驟：

A.睡美人CAR微環(huán)母體質(zhì)粒和睡美人轉(zhuǎn)座酶微環(huán)母體質(zhì)粒的構(gòu)建：合成構(gòu)建靶向CD133且能分泌PD1-scFv的CAR序列，兩端插入睡美人轉(zhuǎn)座子所需的末端重復序列，將上述基因序列通過同源重組的方法構(gòu)建入微環(huán)母體質(zhì)粒中，即為睡美人CAR微環(huán)母體質(zhì)粒；合成構(gòu)建睡美人轉(zhuǎn)座酶序列，兩端插入睡美人轉(zhuǎn)座子所需的末端重復序列，將上述基因序列通過酶切方式構(gòu)建入微環(huán)母體質(zhì)粒中，即為睡美人轉(zhuǎn)座酶微環(huán)母體質(zhì)粒。