[發(fā)明專利]基于非病毒載體的CD133特異性且自分泌PD1 scFv的CAR-T細胞的制備方法

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• 申請日: 2021-06-07
• 公開（公告）號: CN113684226A
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發(fā)明（設計）人: 夏建川;楊朝聘
• 申請（專利權）人: 夏建川
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/64;C12N15/62;C12N5/10
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 劉孟斌

1.一種基于非病毒載體的CD133特異性且自分泌PD1 scFv的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

A.睡美人CAR微環(huán)母體質(zhì)粒和睡美人轉座酶微環(huán)母體質(zhì)粒的構建：合成構建靶向CD133且能分泌PD1-scFv的CAR序列，兩端插入睡美人轉座子所需的末端重復序列，將上述基因序列通過同源重組的方法構建入微環(huán)母體質(zhì)粒中，即為睡美人CAR微環(huán)母體質(zhì)粒；合成構建睡美人轉座酶序列，兩端插入睡美人轉座子所需的末端重復序列，將上述基因序列通過酶切方式構建入微環(huán)母體質(zhì)粒中，即為睡美人轉座酶微環(huán)母體質(zhì)粒；

B.睡美人CAR微環(huán)質(zhì)粒和睡美人轉座酶微環(huán)質(zhì)粒的制備：將步驟A所構建的睡美人CAR微環(huán)母體質(zhì)粒和睡美人轉座酶微環(huán)母體質(zhì)粒在42℃通過熱激的方法轉入感受態(tài)細胞中，隨后加入200μl SOC培養(yǎng)基，置于搖床上37℃、250rpm搖60min，隨后將菌液涂于含卡那抗性的培養(yǎng)板上，37℃過夜培養(yǎng)；第二天，挑單克隆至含卡那抗性的400ml LB培養(yǎng)基中，30℃、250rpm搖4～6小時，隨后轉至400ml TB培養(yǎng)基中，37℃、250rpm過夜培養(yǎng)，但不超過16小時；第三天加入等體積的LB培養(yǎng)基，進行阿拉伯糖誘導培養(yǎng)，在32℃、250rpm置于搖床上再搖5h,離心收菌液沉淀，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測濃度，得到睡美人CAR微環(huán)質(zhì)粒和睡美人轉座酶微環(huán)質(zhì)粒；

C.電轉制備CAR-T細胞：用磁珠分選PBMC中的T細胞，計算細胞的密度，取1×10⁷個T細胞，離心去除上清，DPBS洗2遍，100μl電轉液重懸細胞，并將制備好的睡美人CAR微環(huán)質(zhì)粒和睡美人轉座酶微環(huán)質(zhì)粒按1:1的比例加入電轉液進行電轉，電轉取出后放入預包被CD133抗原和CD28抗體的6孔板中，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，電轉后的培養(yǎng)基采用T細胞無血清培養(yǎng)基；培養(yǎng)3-5天后，根據(jù)細胞狀態(tài)更換培養(yǎng)液并轉至T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，在第7-10天(根據(jù)細胞擴增數(shù)量)檢測CAR-T陽性率、存活率，并轉移至T75培養(yǎng)瓶中擴增培養(yǎng)；

D.擴增富集CAR-T細胞：繼續(xù)在T75培養(yǎng)瓶中將所述CAR-T細胞培養(yǎng)至第14天或第15天，檢測CAR-T細胞的陽性率，若CAR-T細胞陽性率＞50％，則不進行富集；若CAR-T細胞陽性率＜50％，且細胞數(shù)超過1×10⁷個，則通過加入myctag-生物素抗體對細胞進行富集，并通過磁珠分選得到CAR-T細胞，分選得到后的CAR-T細胞放置在6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

E.CAR-T細胞收獲和鑒定：培養(yǎng)擴增富集后的CAR-T細胞，收集CAR-T細胞，通過流式細胞術檢測CAR-T的陽性率，qPCR和WB共同鑒定，收集細胞上清檢測PD1 scFv的分泌情況；殺傷實驗鑒定細胞的靶向殺傷功能。

2.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟B中，所述阿拉伯糖誘導培養(yǎng)是在800ml LB培養(yǎng)基中加入16ml 1mol/L NaOH和0.4ml 20％L-阿拉伯糖進行培養(yǎng)。

3.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟C中，電轉后的T細胞無血清培養(yǎng)基為X-Vivo培養(yǎng)基，并添加IL-2、IL-7、IL-15和2％FBS進行培養(yǎng)。

4.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟C中，所述擴增培養(yǎng)包括：擴增激活使用CD3/CD28刺激劑，每毫升培養(yǎng)物加入25μl刺激劑；培養(yǎng)T細胞所用培養(yǎng)基為X-Vivo培養(yǎng)基，每毫升培養(yǎng)物加入IL-2 1000IU。

5.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟D中，所述富集的抗體采用myctag-生物素(CST)，二抗采用抗生物素磁珠，過磁珠分離柱，留在柱子上的即為富集的CAR-T細胞，加入5ml洗脫緩沖液于分離柱上，將其從磁力架上取下，用配套的活塞推動柱子，從柱子上下來的即為CAR-T細胞，DPBS洗滌一遍后放于6孔板培養(yǎng)擴增。

6.根據(jù)權利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟D中，每1×10⁷個細胞加入myctag-生物素抗體10μl和抗生物素磁珠20μl。