[發明專利]一種O-乙酰-L-高絲氨酸生產菌、構建方法及應用

有效

• 申請號: 202110627491.2
• 申請日: 2021-06-04
• 公開（公告）號: CN113388564B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 柳志強;李波;張博;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/54;C12N15/70;C12P13/06;C12R1/19
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本發明涉及一種O?乙酰?L?高絲氨酸(OAH)生產菌、構建方法及應用。所述O?乙酰?L?高絲氨酸(OAH)生產菌是以E.coli W3110為底盤菌，將其基因組中的metA、metB、thrB和metJ基因敲除，并增強外源metA基因的表達所得。本發明構建所得OAH生產菌在發酵過程中，能實現發酵液中OAH的積累，OAH搖瓶產量3.58g/L，補料發酵產量16.35g/L，為后續高產OAH工程菌的構建奠定了基礎。

(一)技術領域

本發明屬于代謝工程領域，具體涉及一種O-乙酰-L-高絲氨酸生產菌、構建方法及應用。

(二)背景技術

蛋氨酸是人類和其他動物生活的一種必需氨基酸，是生物體內蛋白質的組成部分。目前，L-蛋氨酸在食品，藥品和飼料添加劑中起著重要的作用，因此具有廣闊的市場應用前景?，F階段，蛋氨酸的合成方法主要有化學法、酶法和微生物發酵法。其中，化學法和酶法的合成前體昂貴且污染嚴重，限制了蛋氨酸的工業生產和應用；由于微生物體內蛋氨酸的合成存在多分支途徑及多水平的調控體系，使微生物合成蛋氨酸陷入產量較低的瓶頸。因此，人們致力于尋找更為理想的蛋氨酸生產方法。

目前，通過微生物發酵生產蛋氨酸前體結合酶催化法逐漸引起人們的關注。O-乙酰-L-高絲氨酸(OAH)是生產高絲氨酸內酯，蛋氨酸和其他有價值化合物的重要平臺代謝中間體。工業上可以以OAH為前體，通過酶法工藝與甲硫醇結合合成蛋氨酸。目前，以O-琥珀酰-L-高絲氨酸(OSH)(O-乙酰-L-高絲氨酸的結構類似物)與甲硫醇直接反應生產L-蛋氨酸和琥珀酸的路線，已在馬來西亞成功運行了數年。因此，構建基因工程菌株生產OAH，再通過酶法合成蛋氨酸具有一定的應用前景。

(三)發明內容

本發明的目的是通過代謝工程技術，提供一種O-乙酰-L-高絲氨酸(OAH)生產菌、構建方法及應用。

為實現本發明的上述目的，本發明采用的技術方案：

一種O-乙酰-L-高絲氨酸生產菌，由如下方法構建獲得：

(1)以E.coli W3110為底盤菌，將其基因組中的metA、metB、thrB和metJ基因敲除，得到重組菌株W3110△metA△metB△thrB△metJ，記為OAHL4；

(2)將源自Bacillus cereus的基因metA(具有metX的催化特性)整合入質粒pACYCDuet-1中，得到質粒pACYCDuet-metA；將質粒pACYCDuet-metA導入步驟(1)所述基因工程菌OAHL4中，得到所述O-乙酰-L-高絲氨酸生產菌(記為OAHL5)。

優選的，所述源自Bacillus cereus的基因metA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本發明還涉及構建所述的O-乙酰-L-高絲氨酸生產菌的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)運用CRISPR-Cas9基因編輯技術，將底盤菌E.coli W3110基因組中的metA、metB、thrB和metJ基因敲除，得到重組菌株W3110△metA△metB△thrB△metJ，記為OAHL4；

(2)將核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的外源基因metA整合入質粒pACYCDuet-1中，得到質粒pACYCDuet-metA；將質粒pACYCDuet-metA導入步驟(1)所述重組菌OAHL4中，得到所述O-乙酰-L-高絲氨酸生產菌(記為OAHL5)。

本發明還涉及所述O-乙酰-L-高絲氨酸生產菌在微生物發酵制備O-乙酰-L-高絲氨酸中的應用。