[發(fā)明專利]一種禽流感病毒H9型的AlphaLISA檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110625853.4
• 申請日: 2021-06-04
• 公開（公告）號: CN113341141A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發(fā)明（設計）人: 吳勝昔;曾政;梁望旺;羅彬彬;侯力嘉;駱璐;曹蕓;陳忠瓊;劉姿怡;黃蕾;陳婷婷;楊溪
• 申請（專利權）人: 重慶理工大學;重慶市動物疫病預防控制中心
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/535;G01N21/76
• 代理公司: 重慶博凱知識產(chǎn)權代理有限公司 50212
• 代理人: 李媛

本發(fā)明公開了一種禽流感病毒H9型的AlphaLISA檢測試劑盒及其檢測方法，所述試劑盒包括如下單獨包裝的A1)?A3)所述的物質：A1)生物素標記的禽流感病毒H9型囊膜蛋白血凝素單克隆抗體；A2)偶聯(lián)有抗禽流感病毒H9型囊膜蛋白血凝素單克隆抗體的受體微球；A3)鏈霉親和素偶聯(lián)供體微球；編碼所述禽流感病毒H9型囊膜蛋白血凝素的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明的檢測方法簡單、檢測時間短，可實現(xiàn)快速檢測目的，無需使用昂貴檢測儀器，不需洗滌，檢測成本低，且檢測靈敏度高、特異性強，不會出現(xiàn)假陽性檢測結果，檢測可靠性更強，更具有市場前景。

技術領域

本發(fā)明涉及獸醫(yī)學、免疫學及生物制品學領域，特別的涉及一種禽流感病毒H9型的AlphaLISA檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

禽流行性感冒(簡稱禽流感)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的全身性或呼吸器官性傳染病，國際獸疫局(OIE)將其定為A類傳染病，并列入國際生物武器公約動物類傳染病名單，我國也將其列為一類動物傳染病。禽流感可表現(xiàn)為亞臨床、輕度呼吸系統(tǒng)疫病、產(chǎn)蛋下降及急性致死性疾病等多種形式。世界各地歷次由特定毒株引起的禽流感的暴發(fā)和流行，均招致禽只的大量死亡和生產(chǎn)性能急劇下降，造成巨大的經(jīng)濟損失。1997年香港H5N1和1999年內(nèi)地和香港H9N2禽流感感染人事件的發(fā)生，更突出地顯示禽流感的公共衛(wèi)生意義。禽流感屬于人畜共患病，控制禽流感不僅需要隔離患者，而且需要對動物疫情進行早期檢驗，切斷動物方面的傳播途徑。防治禽流感是一個長期而艱巨的任務，我國是世界上第一養(yǎng)禽大國，存欄上百億羽，有養(yǎng)雞場幾十萬家，每年需進行禽流感診斷的樣品數(shù)千萬份。因此，各地畜牧獸醫(yī)部門和規(guī)模化養(yǎng)禽企業(yè)都把禽流感作為重大疫病加以防控。因此，早期、快速、準確地診斷該病是防控和凈化該病的關鍵。。

目前，對禽流感病毒的主要檢測技術有病毒的分離與鑒定、血凝-血凝抑制(HA-HI)試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、聚合酶鏈式反應(PCR)和膠體金等方法。病毒的分離鑒定診斷比較準確，但耗時較長，操作繁瑣，不利于快速檢測；HA-HI試驗比較敏感，但受外界因素影響較大而削弱了其實用價值；ELISA法操作簡單，適合于大批量血清學調查，有很大的應用前景，但需反復洗滌，檢測靈敏度有限，且需要一定數(shù)量的樣品；PCR方法雖然可直接檢出病毒的基因，檢測靈敏度高，但檢測成本高、易污染、技術要求比較高，只適合實驗室診斷，不適合臨床感染的快速診斷，如國內(nèi)發(fā)明專利201310176317.6公開了流感病毒N9型RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法，該發(fā)明提供一種禽流感病毒N9型的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包括脫氧三磷酸核苷、MgCl₂、RT-PCR緩沖液、流感病毒N9基因標準品、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及DNA聚合酶等，建立了熒光PCR檢測禽流感病毒，該方法比傳統(tǒng)的PCR方法靈敏度高100-1000倍(0.1TCID50濃度下即有靈敏反應)，但從樣品處理到出結果需要4-5小時，該方法的實施還需熒光定量PCR儀等昂貴儀器，不宜在基層推廣；膠體金方法目前國內(nèi)、外均有相關的產(chǎn)品問世，但其檢測靈敏度不高，產(chǎn)品質量相差大，不宜質控，只能定性，不能定量，該方法只能用于疫病診斷的輔助檢測。因此探索高效、特異、準確的檢測手段對于禽流感的防控具有十分重要的意義。

光激化學發(fā)光免疫檢測技術(AlphaLISA，amplified luminescent proximityhomogeneous assay linked immunosorbent assay)是一種基于微珠的化學發(fā)光的新型均相檢測技術，與傳統(tǒng)的ELISA技術相比具有更高的敏感性、精確性、均一性、背景低、廣泛的動態(tài)檢測范圍，而且無需洗滌及樣本需求量極少等特點，非常便于快速篩選和自動化。近年來該技術已在醫(yī)學及分子生物學領域得到了廣泛的應用。但針對禽流感病毒H9型的AlphaLISA檢測國內(nèi)外均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種禽流感病毒H9型的AlphaLISA檢測試劑盒及其檢測方法，解決針對禽流感病毒檢測存在耗時較長，操作繁瑣及其檢測靈敏度不高等問題。