[發明專利]一種基于表面多刺編碼微球的外泌體捕獲方法

在審

• 申請號: 202110625818.2
• 申請日: 2021-06-04
• 公開（公告）號: CN113358618A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 趙遠錦;李寧;卞非卡;王月桐;張大淦
• 申請（專利權）人: 南京鼓樓醫院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 蔣廈

本發明公開了一種基于表面多刺編碼微球的外泌體捕獲方法，該方法采用的硅酸鹽膠體晶體微球具有鮮艷的結構色，編碼穩定，因其獨特的表面帶刺結構，比表面積大大提升，可偶聯更多的抗體探針，比起常規的光子晶體微球用于檢測具有更高的靈敏度，由于自身的結構特性可以吸附外泌體，具有極高的外泌體捕獲率。

技術領域

本發明涉及一種基于表面帶刺結構的硅酸鹽膠體晶體微球以及以這種微球作為編碼載體進行外泌體捕獲的方法，屬于生物醫學研究，臨床檢測領域。

背景技術

近年來，多重分析和高通量測定引起了極大的研究興趣，這對于疾病診斷，基因表達，藥物篩選等非常重要。其中一種成功的生物技術是懸浮陣列，它使用自編碼的微載體作為檢測元件，與傳統的平面微陣列相比，懸浮微陣列具有更高靈敏的反應速度和更大的靈活性。許多編碼微載體已被提出用于懸浮陣列，包括分段納米棒，光學圖案編碼粒子，半導體量子點(QD)，熒光粒子和光子晶體。其中光子晶體顆粒在懸浮陣列因其出色的光學性能保持著巨大的潛力。但現有報道中的光子晶體表面平整單調，限制了可固定的探針數量，反應效率和靈敏度。

外泌體是由活細胞分泌的直徑約為30-150nm的小囊泡，存在于細胞培養上清液、血清、血漿、唾液、尿液、羊水以及其它生物體液中。外泌體膜為類似于細胞膜的脂質雙分子層，不同類型細胞分泌的外泌體具有很多的共性，包括膜上富含脂類及豐富的跨膜蛋白，如四次跨膜蛋白家族成員的CD63、CD81等，以及膜內包含的各種RNA。外泌體攜帶有大量的蛋白質、脂質、短肽鏈、DNA、RNA、miRNA、環狀RNA等生物活性分子，在細胞外環境中以非常穩定的方式存在，內容物成分與其分泌細胞的組織來源以及分泌細胞的病理生理狀態密切相關。作為細胞間轉運載體，與靶細胞通過膜融合或者內吞作用將內含生物活性物質轉運至靶細胞，從而影響靶細胞的功能，調節靶細胞的代謝，參與免疫應答、炎癥反應、細胞通訊、細胞凋亡、細胞遷移、血管生成和腫瘤細胞生長等重要病理生理過程，實現遠距離信息傳遞、調控的功能。現階段的外泌體捕獲技術往往存在很多問題，提出的外泌體純度不高，且步驟繁瑣。基于仿花粉結構的表面帶刺微球，由于其自身的結構優勢可以有效捕獲外泌體，通過偶聯特異性的探針，還可實現多路篩選。

發明內容

本發明在于提出本發明涉及一種基于表面帶刺結構的硅酸鹽晶體反結構微球以及以這種微球作為編碼載體進行外泌體捕獲的方法，具有良好的應用前景。

為了解決現有的光子晶體微球用于外泌體捕獲效率較低的問題，本發明提供的技術方案是：表面帶刺結構的硅酸鹽微球用于外泌體捕獲的方法，包括以下步驟：

(1)抗體探針的偶聯：

為偶聯抗體探針，將帶刺微球用APTES的酒精溶液浸泡若干小時，再用丁二酸酐溶液浸泡過夜，然后在MES緩沖液體系中，使用EDC和NHS活化羧基，浸泡8-15分鐘；用PBS緩沖液洗滌后，將帶刺微球與抗體探針在37℃下反應過夜；最后，在恒溫搖床中，在37℃下，用BSA封閉帶刺微球表面上未反應的羧基，然后用靶標外泌體的抗體修飾不同顏色的編碼帶刺微球；

(2)癌細胞來源外泌體的捕獲：

將制備的抗體修飾的編碼帶刺微球與恒定溫度的搖床中與經超速離心提純后的外泌體PBS溶液在37℃下孵育過夜；孵育后，將捕獲到外泌體的編碼帶刺微球用PBS緩沖液洗滌，然后在37℃下使用鈣黃綠素進行外泌體熒光染色；最后，用PBS緩沖液徹底沖洗掉多余的鈣黃綠素，并通過連接計算機的光譜儀和熒光顯微鏡讀取和記錄帶刺微球的熒光強度。

步驟(1)所述的APTES酒精溶液配比為5％v/v，丁二酸酐溶液中配比為丁二酸酐/DMSO溶液1mg/mL。

步驟(2)所述的超速離心提純前應使用0.22微米超濾膜過濾細胞培養上清液，離心轉速為100000rpm。

為使鈣黃綠素更容易進入細胞，步驟(2)所述的鈣黃綠素為AM修飾的鈣黃綠素，熒光為綠色熒光，由藍光激發。