[發明專利]一種基于表面多刺編碼微球的外泌體捕獲方法

在審

• 申請號: 202110625818.2
• 申請日: 2021-06-04
• 公開（公告）號: CN113358618A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 趙遠錦;李寧;卞非卡;王月桐;張大淦
• 申請（專利權）人: 南京鼓樓醫院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 蔣廈

1.一種基于表面多刺編碼微球的外泌體捕獲方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)抗體探針的偶聯：

為偶聯抗體探針，將帶刺微球用APTES的酒精溶液浸泡若干小時，再用丁二酸酐溶液浸泡過夜，然后在MES緩沖液體系中，使用EDC和NHS活化羧基，浸泡8-15分鐘；用PBS緩沖液洗滌后，將帶刺微球與抗體探針在37℃下反應過夜；最后，在恒溫搖床中，在37℃下，用BSA封閉帶刺微球表面上未反應的羧基，然后用靶標外泌體的抗體修飾不同顏色的編碼帶刺微球；

(2)癌細胞來源外泌體的捕獲：

將制備的抗體修飾的編碼帶刺微球與恒定溫度的搖床中與經超速離心提純后的外泌體PBS溶液在37℃下孵育過夜；孵育后，將捕獲到外泌體的編碼帶刺微球用PBS緩沖液洗滌，然后在37℃下使用鈣黃綠素進行外泌體熒光染色；最后，用PBS緩沖液徹底沖洗掉多余的鈣黃綠素，并通過連接計算機的光譜儀和熒光顯微鏡讀取和記錄帶刺微球的熒光強度。

2.根據權利要求1所述的一種基于表面多刺編碼微球的外泌體捕獲方法，其特征在于，步驟(1)所述的APTES酒精溶液配比為5％v/v，丁二酸酐溶液中配比為丁二酸酐/DMSO溶液1mg/mL。

3.根據權利要求1所述的一種基于表面多刺編碼微球的外泌體捕獲方法，其特征在于，步驟(2)所述的超速離心提純前應使用0.22微米超濾膜過濾細胞培養上清液，離心轉速為100000rpm。

4.根據權利要求1所述的一種基于表面多刺編碼微球的外泌體捕獲方法，其特征在于，為使鈣黃綠素更容易進入細胞，步驟(2)所述的鈣黃綠素為AM修飾的鈣黃綠素，熒光為綠色熒光，由藍光激發。

5.根據權利要求1所述的一種基于表面多刺編碼微球的外泌體捕獲方法，其特征在于，步驟(2)所述的外泌體捕獲為對特定癌癥細胞外泌體響應的抗體探針修飾的帶刺微球，當其在含有相應靶標的溶液中孵育后，通過鈣黃綠素染色，觀測到明顯熒光。