[發明專利]產西柏三烯一醇的釀酒酵母的構建方法及應用

在審

• 申請號: 202110621179.2
• 申請日: 2021-06-03
• 公開（公告）號: CN113388536A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 陳獻忠;楊海泉;張坤杰;劉萬隆;董田田;沈微;夏媛媛;陳磊;曹鈺
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/88;C12N9/10;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/81;C12P7/02;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了產西柏三烯一醇的釀酒酵母的構建方法及應用，屬于代謝工程和微生物工程領域。本發明通過在釀酒酵母W303?1A中異源表達西柏三烯一醇合成的2個關鍵酶香葉基香葉基焦磷酸合酶基因ggpps和西柏三烯醇合酶基因cbts，實現了西柏三烯一醇在釀酒酵母中的從頭生產，并進一步通過與西柏三烯醇合酶基因cbts的串連過表達關鍵酶法尼基焦磷酸合成酶(ERG20)，獲得的重組菌株的西柏三烯一醇產量顯著提高。將上述途徑構建至釀酒酵母BY4741中，其西柏三烯一醇的產量提高至對照菌株的3倍。在關鍵酶法尼基焦磷酸合成酶基因前添加啟動子，進一步提高重組釀酒酵母的西柏三烯一醇產量。

技術領域

本發明涉及產西柏三烯一醇的釀酒酵母的構建方法及應用，屬于代謝工程和微生物工程領域。

背景技術

在全球殺蟲劑市場的背景下，化學合成的活性化合物，如人造除蟲菊衍生物和最顯著的新煙堿類(如吡蟲啉、噻蟲嗪和噻蟲胺；價值18.9億美元)，其可快速作用害蟲但非目標判別產品。新煙堿類是通過與煙堿乙酰膽堿受體不可逆結合而介導所有昆蟲神經毒性作用的主要殺蟲劑類別。化學農藥具有諸多缺點，例如：易造成環境污染、目標種群逐漸養成抗藥性、其對非目標種群具有負面性等。因此，這些化合物會影響害蟲以及蜜蜂和熊蜂等有益昆蟲，從而對農村地區的農作物和生物多樣性的授粉產生負面影響。化學殺蟲劑甚至危及工業農業活動和仍在增長的人口的可持續性。此外，這些化學品的生物降解性很差，導致環境積累，對陸地和水生生態系統的生物多樣性產生負面影響。新煙堿類的廣泛環境影響最近引發歐洲委員會嚴格限制這些化合物在農業活動中的適用性。

生物農藥亦稱為天然農藥，是來自天然的化學物質或者生命體，具有殺菌農藥和殺蟲農藥的作用。相比而言，生物農藥具有諸多優點：選定的天然殺蟲化合物對脫靶昆蟲無毒、確保僅對農業活動和作物產量產生積極影響、對人畜安全、對生態環境影響小、誘發害蟲患病、可利用農副產品加工生產、易被陸地微生物或光迅速降解、不會積累等。我國生物農業類型主要包括微生物農藥、植物源農藥、農用抗生素、天敵昆蟲農藥、生物化學農藥、植物生長調節劑類農藥等六大類型。西柏三烯一醇作為一種重要的二萜類化合物，是植物的分泌物成分，代表植物防御昆蟲、病原微生物和食草動物的主要成分，在生物防治方面具有重要作用與意義。西柏三烯一醇只能在植物中以痕量檢測到，但其具有顯著的殺蟲活性，且在自然降解過程中不會在生態圈中積累。

同時，西柏三烯一醇也是煙草中香味物質之一，對于煙草的品質具有重要影響與作用意義。雖然近年來西柏三烯一醇受到了一定關注，但相關報道與數據較少。西柏三烯一醇可以從植物中提取獲得，但由于其在植物中只能以痕量檢測到，含量較少。所以，通過從植物中提取的方法獲得西柏三烯一醇具有一定的挑戰，且生產成本太高，不利于其在農業生產中的應用。西柏三烯一醇具有復雜的化學結構又難以化學合成。因此，利用微生物生物合成西柏三烯一醇具有很大的前景及價值。研究表明萜類化合物在生物合成中可通過甲羥戊酸途徑(MEV)合成，這為通過合成生物學方法在微生物宿主(如釀酒酵母)中生產西柏三烯一醇奠定了基礎。作為真核微生物的釀酒酵母菌株，具有遺傳信息清晰、生長快速、不易污染濕菌體、培養基廉價、對于化學物質(如萜類)具有較高耐受性等優點，適合用于精細化學品的高效生產。但單一的重組菌株構建方式，不利于重組微生物高效工業化生產西柏三烯一醇。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了產西柏三烯一醇的釀酒酵母的構建方法，通過關鍵酶法尼基焦磷酸合成酶(ERG20)的過量表達、宿主優化、啟動子調控等方法及應用，可高效生產西柏三烯醇，促進其在農業及煙草等領域中的應用。

本發明的第一個目的是提供一株產西柏三烯一醇的釀酒酵母菌株，表達了西柏三烯醇合酶、香葉基焦磷酸(GGPP)合酶和法尼基焦磷酸合成酶(ERG20)；所述西柏三烯醇合酶含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述香葉基焦磷酸(GGPP)合酶含有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；所述法尼基焦磷酸合成酶含有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

在一種實施方式中，所述釀酒酵母以釀酒酵母W303-1A或釀酒酵母BY4741為宿主。