[發明專利]一種用于制備L-塔格糖的雙酶催化體系及應用

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• 申請號: 202110620147.0
• 申請日: 2021-06-03
• 公開（公告）號: CN113337484A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 蘇文彬;范小蔓;黃佳瀅;李學勇;張業旺
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N9/02;C12P19/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種用于制備L?塔格糖的雙酶催化體系及應用，屬于生物工程技術領域；本發明中，將來源于變形鏈球菌的產水型NADH氧化酶和來源于球形紅球菌的半乳糖醇脫氫酶偶聯構建成用于制備L?塔格糖的多酶催化體系，該多酶催化體系生產成本低、無其他副產物、純化難度低。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種用于制備L-塔格糖的雙酶催化體系及應用。

背景技術

L-塔格糖（D-塔格糖的對映異構體）是一種理想的甜味劑和增味劑，可作為多種重要化合物如L-脫氧-半乳糖苷嘧啶和1,2,3,4-二-異丙基-呋喃糖的合成原料，在食品行業具有廣闊的應用前景。但是，L-塔格糖的合成成本高，產量低，難以進行大規模的應用。

目前，主要用化學合成法和生物合成法來制備L-塔格糖。化學合成法轉化率較低，生成的副產物較多以及官能團保護及脫保護反應十分復雜，難以進一步應用于L-塔格糖的工業生產。生物合成法主要采用全細胞（表達半乳糖醇脫氫酶）或純化后的半乳糖醇脫氫酶（GatDH）以D-半乳糖醇為底物催化合成L-塔格糖，該方法轉化率高且簡單快捷，但仍存在一些不足。如全細胞法無法以較高濃度的D-半乳糖醇為底物有效合成L-塔格糖，并且當重組細胞中局部的半乳糖醇脫氫酶的濃度較高，細胞內部輔酶NAD⁺的自身再生過程無法有效滿足細胞催化反應過程中大量NAD⁺的需求，進而影響L-塔格糖產率。

基于球形紅桿菌D（Rhodobacter sphaeroides D）的半乳糖醇脫氫酶GatDH的無細胞生物催化法雖然不存在細菌細胞壁阻礙，并且可外部提供輔因子而更適用于L-塔格糖的大量生產，但在生產過程中仍需要持續添加昂貴的輔酶NAD⁺。盡管上述體系中可通過以乳酸脫氫酶作為NAD⁺再生酶，并以乳酸作為共底物催化NADH轉化為NAD⁺，但乳酸的添加以及反應中形成的大量的副產物丙酮酸可能會極大影響酶的催化效率，還會增加產物L-塔格糖的分離純化難度從而極大增加L-塔格糖合成成本。

發明內容

針對現有技術中存在不足，本發明提供了一種用于制備L-塔格糖的雙酶催化體系及應用。本發明中，將來源于變形鏈球菌的產水型NADH氧化酶和來源于球形紅球菌的半乳糖醇脫氫酶偶聯構建成用于制備L-塔格糖的多酶催化體系，該多酶催化體系生產成本低、無其他副產物、純化難度低。

本發明中首先提供了一種用于制備L-塔格糖的雙酶催化體系，所述多雙催化體系包含NADH氧化酶、半乳糖醇脫氫酶和NAD⁺輔酶因子，其中，體系中NADH氧化酶、半乳糖醇脫氫酶和NAD⁺輔酶因子用量比為1-1.5 U/mL：2-2.25 U/mL：1~3 mM。

進一步的，所述NADH氧化酶為變形鏈球菌（Streptococcus mutans）的產水型NADH氧化酶。

進一步的，所述半乳糖醇脫氫酶為球形紅球菌（Rhodobacter sphaeroides）的半乳糖醇脫氫酶。

本發明中還提供了上述用于制備L-塔格糖的雙酶催化體系在生物催化合成L-塔格糖中的應用，具體包括如下步驟：

將D-半乳糖醇用Tris-HCl緩沖液溶解，然后加入半乳糖醇脫氫酶液和NADH氧化酶液，然后加入NAD⁺輔酶因子，得到反應體系，磁力攪拌反應，得到L-塔格糖。

進一步的，所述Tris-HCl緩沖液的pH值為9.0。

進一步的，D-半乳糖醇用Tris-HCl緩沖液溶解后濃度為100 mM。

進一步的，所述半乳糖醇脫氫酶在反應體系中的終濃度為1~1.5 U/mL，NADH氧化酶酶液在反應體系中的終濃度為2~2.25 U/mL。