[發(fā)明專利]一種封閉區(qū)pH調(diào)控觸發(fā)的破骨細(xì)胞囊泡及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110620061.8
• 申請(qǐng)日: 2021-06-03
• 公開（公告）號(hào): CN113564112A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顧辰輝;林賢豐;范順武
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/078
• 分類號(hào): C12N5/078;A61K35/14;A61P19/08
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 楊舟濤

本專利發(fā)明了一種封閉區(qū)pH調(diào)控觸發(fā)的破骨細(xì)胞囊泡及其應(yīng)用。通過對(duì)破骨細(xì)胞封閉區(qū)pH進(jìn)行調(diào)控，可使破骨細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外囊泡，這種囊泡富含RANK，可用于拮抗RANKL，從而達(dá)到抑制破骨細(xì)胞效果。本發(fā)明通過封閉區(qū)pH調(diào)控觸發(fā)產(chǎn)生破骨細(xì)胞囊泡，機(jī)制創(chuàng)新；采用破骨細(xì)胞來源的囊泡進(jìn)行破骨細(xì)胞調(diào)控，具有自體優(yōu)勢(shì)，生物安全性高；效果明確，可有效抑制破骨細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種封閉區(qū)pH調(diào)控觸發(fā)的破骨細(xì)胞囊泡及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)胞外囊泡是由細(xì)胞分泌的一類微顆粒，通常攜帶蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和脂質(zhì)等生物活性分子，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞交互，在細(xì)胞的信號(hào)傳遞中起重要作用。尤其是外泌體，已在組織修復(fù)領(lǐng)域獲得廣泛研究，其生物活性分子的作用及機(jī)制明確。

破骨細(xì)胞封閉區(qū)是成熟破骨細(xì)胞形成的封閉吸收區(qū)，內(nèi)部pH約為4.5，富含TRAP、CTSK等基質(zhì)降解酶，在破骨細(xì)胞功能行使中起重要作用，同時(shí)作為破骨細(xì)胞微環(huán)境的重要組成部分，其形成機(jī)制及影響因素也受到廣泛關(guān)注。

目前對(duì)于破骨細(xì)胞細(xì)胞外囊泡相關(guān)材料的專利十分少見，均停留于異種細(xì)胞來源囊泡對(duì)破骨細(xì)胞的作用。申請(qǐng)?zhí)枮镃N202011412766.2的專利公開了一種靶向破骨細(xì)胞的外泌體藥物遞送系統(tǒng)的制備方法及其應(yīng)用，從細(xì)胞系獲取外泌體并包載藥物，實(shí)現(xiàn)對(duì)破骨細(xì)胞功能的調(diào)控。申請(qǐng)?zhí)朇N202110034338.9的專利公開了一種腫瘤來源外泌體在制備促進(jìn)破骨分化和骨溶解藥物中的用途，同樣只背了腫瘤來源外泌體并進(jìn)行破骨細(xì)胞調(diào)控，未進(jìn)行材料來源和調(diào)控機(jī)制的創(chuàng)新。諸如此類的專利均限制于異體細(xì)胞來源的外泌體材料，生物安全性低。因此需要一種自體細(xì)胞來源的破骨細(xì)胞囊泡，使其具有高度生物安全性，且機(jī)制創(chuàng)新明確。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種封閉區(qū)pH調(diào)控觸發(fā)的破骨細(xì)胞囊泡及其應(yīng)用。通過對(duì)破骨細(xì)胞封閉區(qū)pH進(jìn)行調(diào)控，可使破骨細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外囊泡，這種囊泡富含RANK，可用于拮抗RANKL，從而達(dá)到抑制破骨細(xì)胞效果。。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：提取骨髓來源單核巨噬細(xì)胞，M-CSF+RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞，使用藥物調(diào)控破骨細(xì)胞封閉區(qū)pH，收集破骨細(xì)胞囊泡。

進(jìn)一步，所述M-CSF濃度為10-50ng/mL，優(yōu)選地，采用20ng/mL濃度。

進(jìn)一步，所述RANKL濃度為25-100ng/mL，優(yōu)選地，采用50ng/mL濃度。

進(jìn)一步，所述藥物調(diào)控方式包括培養(yǎng)基pH調(diào)控和靶向封閉區(qū)pH調(diào)控，優(yōu)選地，采用靶向封閉區(qū)pH調(diào)控，更優(yōu)選地，采用堿性內(nèi)容脂質(zhì)體調(diào)控。

進(jìn)一步，所述破骨細(xì)胞囊泡收集方式包括差速離心法、密度梯度離心法、超濾法、沉淀法、免疫分離法、篩分離法。優(yōu)選地，采用差速離心+超濾法。

相比現(xiàn)有破骨細(xì)胞調(diào)控的材料，本發(fā)明顯著的進(jìn)步在于：

1)封閉區(qū)pH調(diào)控觸發(fā)產(chǎn)生破骨細(xì)胞囊泡，機(jī)制創(chuàng)新。

2)采用破骨細(xì)胞來源的囊泡進(jìn)行破骨細(xì)胞調(diào)控，具有自體優(yōu)勢(shì)，生物安全性高。

3)效果明確，可有效抑制破骨細(xì)胞。

因此，封閉區(qū)pH調(diào)控觸發(fā)的破骨細(xì)胞囊泡可保證生物安全性和機(jī)制創(chuàng)新性，并具有高效性。

附圖說明

圖1破骨細(xì)胞成熟過程中RANK的伴隨表達(dá)熒光圖；

圖2破骨細(xì)胞成熟過程中RANK的伴隨表達(dá)蛋白印跡圖；

圖3封閉區(qū)pH調(diào)控引起的破骨細(xì)胞囊泡的RANK蛋白印跡圖；

圖4封閉區(qū)pH調(diào)控引起的破骨細(xì)胞囊泡的流式計(jì)數(shù)；