[發明專利]一種封閉區pH調控觸發的破骨細胞囊泡及其應用

在審

• 申請號: 202110620061.8
• 申請日: 2021-06-03
• 公開（公告）號: CN113564112A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 顧辰輝;林賢豐;范順武
• 申請（專利權）人: 浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;A61K35/14;A61P19/08
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 楊舟濤

1.一種封閉區pH調控觸發的破骨細胞囊泡的提取方法，其特征在于，該方法具體為：提取骨髓來源單核巨噬細胞，采用M-CSF+RANKL誘導破骨細胞，使用藥物調控破骨細胞封閉區pH，收集破骨細胞囊泡。

2.根據權利要求1所述的一種封閉區pH調控觸發的破骨細胞囊泡的提取方法，其特征在于：所述的藥物調控方式包括培養基pH調控和靶向封閉區pH調控。

3.根據權利要求1所述的一種封閉區pH調控觸發的破骨細胞囊泡的提取方法，其特征在于：所述的藥物調控方式采用堿性內容脂質體調控。

4.根據權利要求1所述的一種封閉區pH調控觸發的破骨細胞囊泡的提取方法，其特征在于：所述的收集破骨細胞囊泡，具體方式為差速離心法、密度梯度離心法、超濾法、沉淀法、免疫分離法、篩分離法中的一種或多種。

5.根據權利要求1所述的一種封閉區pH調控觸發的破骨細胞囊泡的提取方法，其特征在于：所述的收集破骨細胞囊泡的方式采用差速離心+超濾法。

6.根據權利要求1所述的一種封閉區pH調控觸發的破骨細胞囊泡的提取方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟：

步驟一：培養骨髓來源單核巨噬細胞，加入20ng/mL M-CSF誘導；

步驟二：5天后，采用20ng/mL M-CSF+50ng/mL RANKL誘導破骨細胞；

步驟三：3天后，加入四環素修飾的骨靶向碳酸氫鈉脂質體，并換無血清培養基，每天收集上清；

步驟四：梯度離心，200×g離心15min，2500×g離心15min；

步驟五：取上清，使用0.22μm過濾器過濾上清液，以去除殘留的細胞和碎片；

步驟六：用超速離心過濾器裝置轉移溶液；

將溶液以4,000×g離心，直到上層隔室中的體積濃縮至約200μL；

步驟七：用磷酸鹽緩沖液洗滌超濾溶液，并重復離心3次；

步驟八：將洗滌后的含有外泌體的超濾液體超速離心1小時；將沉淀重懸于PBS中，并以4,000×g離心以將體積濃縮至約200μL。

7.根據權利要求1所述的一種封閉區pH調控觸發的破骨細胞囊泡的提取方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟：

步驟一：培養骨髓來源單核巨噬細胞，加入20ng/mL M-CSF誘導；

步驟二：5天后，采用20ng/mL M-CSF+50ng/mL RANKL誘導破骨細胞；

步驟三：3天后，加入四環素修飾的骨靶向磷酸氫二鈉脂質體，并換無血清培養基，每天收集上清；

步驟四：使用Percoll密度梯度離心液1000×g，20min離心；

步驟五：吸取上層交界面的外泌體層液體，加入2倍體積PBS混勻；

步驟六：使用0.22μm過濾器過濾，以去除殘留的細胞和碎片，用超速離心過濾器裝置轉移溶液；將溶液以4,000×g離心，直到上層隔室中的體積濃縮至約200μL；

步驟七：用磷酸鹽緩沖液洗滌，并重復離心3次；

步驟八：將沉淀用200μL PBS重懸。

8.根據權利要求1所述的一種封閉區pH調控觸發的破骨細胞囊泡的提取方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟：

步驟一：培養骨髓來源單核巨噬細胞，加入20ng/mL M-CSF誘導；

步驟二：5天后，采用20ng/mL M-CSF+50ng/mL RANKL誘導破骨細胞；

步驟三：3天后，換無血清培養基，并調節pH至8.0，每天收集上清；

步驟四：梯度離心，以300×g離心10分鐘，取上清；

步驟五：以2000×g離心10分鐘，取上清；

步驟六：10，000×g離心30分鐘，取上清；

步驟七：100，000×g，在4℃下持續離心90分鐘，去掉上清，留下的沉淀PBS重懸后，再次以100，000×g離心90分鐘；

步驟八：將沉淀用200μL PBS重懸。

9.一種封閉區pH調控觸發的破骨細胞囊泡的應用，其特征在于：一種封閉區pH調控觸發的破骨細胞囊泡在抑制破骨細胞形成中應用。