[發(fā)明專利]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)制備柑橘純合突變體的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110617137.1
• 申請(qǐng)日: 2021-06-03
• 公開（公告）號(hào): CN113215190B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭愛紅;鄒修平;何永睿;陳善春;許蘭珍;雷天剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/78
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責(zé)任公司 50209
• 代理人: 張建

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)獲得柑橘純合突變體的方法。所述方法包括以下步驟：將柑橘上胚軸莖段與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，隨即對(duì)上胚軸莖段進(jìn)行熱處理，然后將上胚軸莖段轉(zhuǎn)入添加1 mg/L BA、0.5 mg/L IAA和40 mg/L Km的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)。該方法能夠提高純合突變體的基因編輯效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)制備柑橘純合突變體的方法。

背景技術(shù)

柑橘又名柑桔，為蕓香科柑橘屬植物，包含了柑、桔、橙、柚、檸檬等多個(gè)品種。柑橘果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，含有黃酮類、檸檬苦素類、生物堿類、香豆素及維生素等多種活性成分，具有抗癌、預(yù)防心血管疾病等功效(“柑橘屬中生物堿的研究進(jìn)展”，趙雪梅等，中國(guó)藥房，2008年第19卷第9期，第703頁(yè)第1段第1-3行，公開日2008年5月29日；“蕓香科柑桔數(shù)黃酮類成分質(zhì)量研究”，史銳等，中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012年第30卷第6期，第585頁(yè)左欄第1段第1-3行，公開日2012年6月30日)。

然而，我國(guó)在柑橘品種選育方面仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。現(xiàn)階段，普遍采用有性雜交、芽變選種、實(shí)生選種、誘變育種等方法進(jìn)行優(yōu)良品種選育。但是，這些方法需要時(shí)間較長(zhǎng)。而基因工程能夠特異地改造基因組。目前，人們采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行柑橘育種研究(“柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化及利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)突變山金柑基因”，郭文武，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，第1頁(yè)第2段第2-11行，2018年，公開日2018年9月18日)。然而，利用CRISPR/Cas9獲得柑橘純合突變體的效率較低。如Peng等(2017)和Jia等(2020) 分別從32個(gè)和8個(gè)含有CRISPR/Cas9系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植株中獲得了1個(gè)純合突變體，純合突變體的基因編輯效率僅分別為3.1％(“Engineering canker-resistant plants through CRISPR/Cas9-targeted editing of the susceptibility gene CsLOB1 promoter in citrus”，Peng Aihong等，Plant Biotechnology Journal，第4頁(yè)第2段第8行，2017年，公開日2017年3 月29日)和12.5％(“Generation of homozygous canker-resistant citrus in the T0generation using CRISPR-SpCas9p”，Jia Hongge等，Plant Biotechnology Journal，第2頁(yè)第1段第3-4行，2020 年，公開日2020年3月13日)。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種制備柑橘純合突變體的方法，以提高純合突變體的基因編輯效率。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

制備柑橘純合突變體的方法，包括以下步驟：

將柑橘上胚軸莖段與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，隨即對(duì)上胚軸莖段進(jìn)行熱處理，然后將上胚軸莖段轉(zhuǎn)入添加1mg/L BA(芐氨基腺嘌呤)、0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)和40mg/L Km(卡那霉素)的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)。

本發(fā)明中，所述共培養(yǎng)為將上胚軸莖段置于含有p35SCas9/CsLOB1sgRNA質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液中進(jìn)行侵染；

然后將上胚軸莖段置于添加1mg/L 2-ip(異戊烯腺嘌呤)、0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)、1 mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和100μM AS(乙酰丁香酮)的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)。

進(jìn)一步，所述共培養(yǎng)是指于26℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)60h。

進(jìn)一步，所述熱處理所采用的培養(yǎng)基為添加2mg/L BA(芐氨基腺嘌呤)、70mg/L Km(卡那霉素)和500mg/L Cef(頭孢霉素)的MS培養(yǎng)基。