[發(fā)明專利]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)制備柑橘純合突變體的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110617137.1
• 申請(qǐng)日: 2021-06-03
• 公開（公告）號(hào): CN113215190B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭愛紅;鄒修平;何永睿;陳善春;許蘭珍;雷天剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/78
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責(zé)任公司 50209
• 代理人: 張建

1.一種基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)制備柑橘純合突變體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將柑橘上胚軸莖段與含有p35SCas9/CsLOB1sgRNA質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，隨即對(duì)上胚軸莖段進(jìn)行熱處理，然后將上胚軸莖段轉(zhuǎn)入添加1 mg/L BA、0 .5 mg/L IAA和40 mg/L Km的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)；所述熱處理是指先在37℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)1 d，接著在26℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)1 d；如此循環(huán)5次；所述CsLOB1sgRNA序列為5′-TCCTGTTTACGGCTGCGCCG-3′。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培養(yǎng)是指于26℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)60 h。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述熱處理所采用的培養(yǎng)基為添加2mg/L BA、70 mg/L Km和500 mg/LCef的MS培養(yǎng)基。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)是指將上胚軸莖段置于添加1mg/L BA、0 .5 mg/L IAA和40 mg/L Km的MS培養(yǎng)基上，并在16 h的光周期、溫度為28℃條件下誘導(dǎo)至上胚軸莖段兩端的傷口上生出不定芽。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)是指將上胚軸莖段置于添加1mg/L BA、0 .5 mg/L IAA和40 mg/L Km的MS培養(yǎng)基上，并在16 h的光周期、溫度為28℃條件下誘導(dǎo)至上胚軸莖段兩端的傷口上生出不定芽。