[發明專利]一種基于數字PCR檢測血漿游離DNA甲基化的組合物及其應用

在審

• 申請號: 202110616122.3
• 申請日: 2021-06-02
• 公開（公告）號: CN113278699A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 田亞平;張朋軍;隋亞鑫
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 鎮江至睿專利代理事務所(普通合伙) 32529
• 代理人: 劉靜

本發明公開了一種基于數字PCR技術檢測胃癌血漿cfDNA中基因Reprimo和/或基因RNF180甲基化的組合物、試劑盒及檢測方法。本發明基于微滴式數字PCR技術絕對定量檢測胃癌血漿cfDNA中Reprimo基因或RNF180基因甲基化的檢測方法，該方法檢測靈敏度高，結果精準，可絕對定量，有著廣闊的應用前景和產業化前景。更重要的是，本發明將胃癌標志物Reprimo基因或RNF180基因的甲基化進行聯合檢測，通過實驗證明，多參數聯合診斷分析用于區分健康對照組和GC組以及良性組和GC組的診斷價值優于單項參數檢測，可實現胃癌診斷的早發現、早預防，對于胃癌的治療和預后有著重要意義。

相關申請的交叉引用

本申請要求2021年06月01日向中國國家知識產權局提交的、專利申請號為202110608386.4的專利申請的優先權，其全部內容以引用的方式并入本文中。

技術領域

本發明屬于甲基化檢測技術領域，涉及一種基于數字PCR檢測血漿游離DNA甲基化的組合物及其應用。

背景技術

根據國際癌癥研究機構(IARC)最新發布的2020年全球最新癌癥數據，胃癌較前一年就新增病例1,089,103例，已經在全球癌癥新發病例數排名中被列為第五位。由于其被診斷出時通常處于晚期，因此胃癌的死亡率很高，其致死病例數占2020年全球癌癥致死總病例的7.7％，位于第四位。早期發現是提高患者生存率和治愈率的關鍵，但目前缺乏準確的非侵入性診斷方法。Reprimo(RPRM)編碼一種高度糖基化的蛋白質，主要存在于細胞質中。該基因跨許多物種表達，與胃腸道，腦血管的發育模式相關。

DNA甲基化是表觀遺傳學的一種調控機制。通過對基因組序列特定區域的CpG堿基組合中的胞嘧啶進行甲基化修飾，變為5-甲基胞嘧啶，引起染色質結構、DNA穩定性等發生改變，從而控制機體基因的表達，參與調節許多生物學過程，如衰老、神經系統發育、原癌基因擴增、腫瘤異質性、耐藥等。研究證實血漿DNA甲基化可以作為多種腫瘤早期輔助診斷的標志物，但血漿中的DNA含量很低，且現有的甲基化檢測方法難以解決血漿痕量DNA和篩選工具起始DNA含量要求較高的矛盾。

RPRM的上調可使p53依賴的G2細胞周期停滯，可作為P53依賴性腫瘤信號通路的潛在抑制劑。RPRM的表觀遺傳沉默主要發生在人類癌癥的早期，主要是通過其啟動子區域的DNA甲基化來實現的。RNF180(ring fingerprotein 180)基因在人類基因組中定位于5q12.3，是一個新型的環指基序基因。相關研究表明，RNF180與細胞分化、增殖、凋亡和腫瘤的發生密切相關，腫瘤中RNF180基因核心啟動子甲基化是其表達進下調或沉默的主要機制。而RNF180基因對胃癌的發生與發展尤其關鍵，表現為腫瘤抑制因子的作用，RNF180的低表達或未表達還與胃癌分期和患者總生存期密切關聯。RNF180甲基化狀態可以作為一個獨立的診斷因子和預后因子應用于臨床診療。

但目前針對上述基因游離DNA甲基化的檢測仍采用熒光定量PCR，基本原理是用亞硫酸氫鹽處理后，使用特定的引物和探針來區分甲基化和非甲基化的基因序列，該方法作為高敏感性DNA甲基化的相對定量檢測技術被廣泛應用，但是，熒光定量法的檢測結果為相對定量，難以實現血漿DNA甲基化高精準度和絕對定量的檢測，導致對胃癌的臨床檢測并不精準。

發明內容

本發明利用數字PCR技術篩選血漿中潛在的敏感特異胃癌早期診斷甲基化標志物，建立穩定的痕量DNA甲基化位點的微滴式數字PCR檢測體系，構建一種甲基化位點輔助診斷指標，為胃癌的早期診斷提供一種非侵入性、敏感特異和準確性高的新型輔助診斷指標。

第一方面，本發明提供了一種基于數字PCR檢測血漿游離DNA甲基化的組合物，所述血漿游離DNA甲基化的標志物為為基因Reprimo和/或基因RNF180。所述組合物包括上游引物、下游引物、甲基化探針M-Probe、非甲基化探針U-Probe。