[發明專利]DNA甲基化的超敏檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 202110615426.8
• 申請日: 2021-06-02
• 公開（公告）號: CN113308518B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 羅陽;張亮亮;趙賢賢;胡孝林;陳恒屹;于興樂
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6827
• 代理公司: 石家莊科誠專利事務所(普通合伙) 13113
• 代理人: 張紅衛;蘇興娟

本發明屬于核酸分析方法技術領域，公開了一種DNA甲基化的超敏檢測方法及其應用，該檢測方法包括依次進行的滾環擴增、內切酶切割二次滾環擴增及CRISPR?Cas12a檢測三個步驟，能實現DNA甲基化信號三重放大及檢測，解決現有DNA甲基化檢測技術中存在的周期長、靈敏度低、成本高等問題。本發明適用于制備試劑盒檢測癌癥等疾病基因甲基化水平，對提升滾環擴增的性能，使其在生物傳感、診斷、藥物篩選和納米技術等領域得到廣泛應用具有十分重要的意義。

技術領域

本發明屬于核酸分析方法技術領域，涉及DNA的檢測方法及其應用，具體地說是一種DNA甲基化的超敏檢測方法及其應用。

背景技術

DNA的甲基化發生是在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化過程，在基因調控區啟動子上富含CpG序列，而這些CpG序列的甲基化水平與基因的表達密切相關。

近年來，隨著聚合酶鏈式反應技術(PCR)的快速發展，抑癌基因的甲基化與癌癥的關系得到不斷深入的研究；研究表明，抑癌基因啟動子區CpG島的異常甲基化導致抑癌基因失活，是癌癥發生的一個重要機制，而且甲基化水平隨著癌癥的發展而提高；一些基因的高甲基化水平有可能成為腫瘤乃至癌細胞形成的標志物，如何在癌癥早期了解相關抑癌基因啟動子區CpG島的甲基化狀態，即如何高效、準確地檢測DNA的甲基化水平，對于及時發現和治療癌癥有著非常重要的意義。

目前，針對DNA甲基化的檢測手段主要有：①直接測序法，這種方法一度被認為是DNA甲基化分析的金標準，但有著需要大量克隆測序，過程較為繁瑣、成本高昂等缺點；②焦磷酸測序法，雖然該法提高檢測速度，但焦磷酸測序的準確性受制于片段長度，CpG與前向引物3’端的距離也可影響檢測結果的準確性；③甲基化敏感性限制性內切酶-PCR法，該法是利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲基化區域不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段后再進行分析，相對簡單、成本低廉、甲基化位點明確，實驗結果易于解釋；但存在非酶切位點的CG位點被忽略、只有檢測與轉錄相關的關鍵性位點的甲基化狀態時，該檢測方法的結果才有意義以及存在著酶消化不完全引起的假陽性問題等缺點；④甲基化特異性PCR法，它是在重亞硫酸鹽處理的基礎上建立的一種方法，該方法很好的避免了使用限制性內切酶及其后續相關的問題，且敏感性高；但仍有需預先知道待測片段的DNA序列、僅可用于定性研究、若待測DNA中5-甲基胞嘧啶分布極不均衡，則檢測復雜程度大增等缺點。因此，亟需提供一種超敏、快速的DNA甲基化檢測技術。

近年來，滾環擴增技術(rolling circle amplification,RCA)作為一種分子擴增方法，與PCR相比，其具有諸多優勢，例如：可在室溫下催化DNA聚合；可以很容易地結合其它檢測平臺(如微陣列)，用于并行的或高通量的分析等，但在納米技術和生物檢測方面的研究和應用，特別是在功能核酸方面的研究和應用仍處于初級階段。

因此，設計一種結合滾環擴增技術與新型基因編輯技術的超敏、快速的DNA甲基化檢測技術，促進將RCA商業化應用于甲基化檢測技術，對提升滾環擴增技術的性能，使其在生物傳感、診斷、藥物篩選和納米技術等領域得到廣泛應用具有十分重要的意義。

發明內容

本發明的一個目的，是要提供一種DNA甲基化的超敏檢測方法，它是由依次進行的滾環擴增技術、內切酶切割觸發二次滾環擴增及CRISPR-Cas12a檢測組成的DNA甲基化信號放大及檢測方法，以實現解決現有技術中存在的檢測周期長、靈敏度低、成本高等問題的目的；

本發明的另一個目的，是要提供上述DNA甲基化的超敏檢測方法的一種應用，它用于制備試劑盒檢測癌癥基因甲基化水平。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種DNA甲基化的超敏檢測方法，它包括依次進行的滾環擴增技術、內切酶切割觸發二次滾環擴增及CRISPR-Cas12a檢測；

該方法是一種DNA甲基化信號放大及檢測方法。