[發(fā)明專利]DNA甲基化的超敏檢測方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110615426.8
• 申請日: 2021-06-02
• 公開（公告）號: CN113308518B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設計）人: 羅陽;張亮亮;趙賢賢;胡孝林;陳恒屹;于興樂
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6827
• 代理公司: 石家莊科誠專利事務所(普通合伙) 13113
• 代理人: 張紅衛(wèi);蘇興娟

1.一種非疾病診斷和治療目的的DNA甲基化的超敏檢測方法，其特征在于，它包括依次進行的滾環(huán)擴增、內(nèi)切酶切割觸發(fā)二次滾環(huán)擴增及CRISPR-Cas12a檢測；

其中，包括依次進行的以下步驟：

S1.RCA擴增：

將2μM待擴增DNA樣品、2μM鎖式探針、2μL T4連接酶、3μL phi29聚合酶及2μL dNTP混勻成體系，于37℃進行滾環(huán)擴增反應，得混合物α；

S2.內(nèi)切酶切割觸發(fā)二次滾環(huán)擴增：

向混合物α加入內(nèi)切酶，切割，使靶標DNA序列游離，進行二次滾環(huán)擴增反應，得產(chǎn)物β；

S3.CRISPR-Cas12a檢測：

取產(chǎn)物β，滅活內(nèi)切酶，設計與產(chǎn)物β序列互補的sgRNA及報告探針，采用CRISPR-Cas12a體系進行反應，通過報告探針檢測，得結果；

步驟S1中，所述待擴增DNA樣品是經(jīng)轉化制得，所述轉化是將DNA樣品的非甲基化的胞嘧啶堿基轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶堿基保持不變；

步驟S2中，所述內(nèi)切酶為雙鏈特異性核酸酶或核酸外切酶III ；所述靶標DNA序列為甲基化序列，該序列與鎖式探針兩端互補。

2.根據(jù)權利要求1所述的非疾病診斷和治療目的的DNA甲基化的超敏檢測方法，其特征在于，所述轉化是取DNA樣品經(jīng)轉化劑轉化處理，得待擴增DNA樣品，備用。

3.根據(jù)權利要求1所述的非疾病診斷和治療目的的DNA甲基化的超敏檢測方法，其特征在于，所述轉化采用的轉化劑為肼鹽、重亞硫酸氫鹽或亞硫酸氫鹽。

4.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的非疾病診斷和治療目的的DNA甲基化的超敏檢測方法，其特征在于，所述報告探針修飾有熒光基團及淬滅基團。