[發明專利]一種檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法

在審

• 申請號: 202110613896.0
• 申請日: 2021-06-02
• 公開（公告）號: CN113325176A
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 溫貴蘭;陳廣;龔新勇;程振濤;文明;孫蕓
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/58;G01N33/543;C07K16/10;C07K16/06
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 張行超

本發明公開了一種檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法，包括：1）用禽白血病病毒RSA株p27基因序列設計一對引物以擴增p27基因，構建重組表達載體經誘導表達獲得重組表達蛋白上清表達，上清表達經過純化后作為免疫原，制備兔源多克隆抗體；2）將包被兔源多克隆抗體的酶標板進行洗滌，37℃封閉1h，洗板；3）加入待檢血清進行孵育，洗板；4）加入酶標抗體進行孵育，洗板；5）加入TMB顯色液顯色，最后加入顯色終止液，終止反應；6）利用酶標儀測定步驟5）酶標板孔中液體OD₄₅₀nm值，根據臨界值判定陰陽性。本發明采用ALV p27蛋白制備兔源多克隆抗體，具有制備周期短，成本低，特異性及重復性好，敏感性高，可靠性好等優點。

技術領域

本發明涉及一種檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法，屬于禽白血病檢測技術領域。

背景技術

禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的雞的腫瘤性疾病之一，自Roloff于1968年報道了歐洲發生的一例雞“淋巴肉瘤”以來，禽白血病多發于禽類，給養禽業造成巨大的經濟損失。p27蛋白是gag基因編碼的禽白血病病毒的群特異性抗原，高度保守，是ALV核心衣殼蛋白的主要成分，有許多易于檢測的病毒抗原位點。在外源性ALV(A，B，C，D，J)各亞群間同源性高達90％。p27蛋白含量高，占病毒總蛋白成分的30％以上，是制備檢測抗體的首選抗原。

發明內容

基于上述，本發明提供一種檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法，方法特異性及重復性好，敏感性高，具有良好的可靠性。

本發明的技術方案是：一種檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法，包括以下步驟：

1)用禽白血病病毒RSA株p27基因序列設計一對引物以擴增p27基因，構建重組表達載體經誘導表達獲得重組表達蛋白上清表達，上清表達經過純化后作為免疫原，制備兔源多克隆抗體；

2)將包被兔源多克隆抗體的酶標板進行洗滌，37℃封閉1h，洗板；

3)加入待檢血清進行孵育，洗板；

4)加入酶標抗體進行孵育，洗板；

5)加入TMB顯色液顯色，最后加入顯色終止液，終止反應；

6)利用酶標儀測定步驟5)酶標板孔中液體OD₄₅₀nm值，根據臨界值判定陰陽性。

可選的，所述禽白血病病毒為病毒RSA株。

可選的，所述一對引物的引物序列如下：

p27-EcoR I-F：CGGAATTCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG；

p27-Xba I-R：GCTCTAGACCTAGGGCTGGATAGCAGAC。

可選的，所述包被兔源多克隆抗體的濃度為4μg/mL，包被條件為37℃2h后4℃過夜，封閉條件為37℃封閉2h。

可選的，所述待檢血清的反應條件為37℃作用0.5h。

可選的，所述酶標抗體的稀釋倍數為1:10000，反應時間為37℃作用1h。

可選的，所述顯示的條件為37℃作用15min.

可選的，所述臨界值判定陰陽性的標準為：當OD₄₅₀nm大于0.222是陽性，小于0.222是陰性。