[發明專利]一種檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法在審
| 申請號： | 202110613896.0 | 申請日： | 2021-06-02 |
| 公開（公告）號： | CN113325176A | 公開（公告）日： | 2021-08-31 |
| 發明（設計）人： | 溫貴蘭;陳廣;龔新勇;程振濤;文明;孫蕓 | 申請（專利權）人： | 貴州大學 |
| 主分類號： | G01N33/569 | 分類號： | G01N33/569;G01N33/58;G01N33/543;C07K16/10;C07K16/06 |
| 代理公司： | 貴陽中新專利商標事務所 52100 | 代理人： | 張行超 |
| 地址： | 550025 貴州省貴*** | 國省代碼： | 貴州;52 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 檢測 白血病 p27 夾心 直接 elisa 方法 | ||
1.一種檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)用禽白血病病毒RSA株p27基因序列設計一對引物以擴增p27基因，構建重組表達載體經誘導表達獲得重組表達蛋白上清表達，上清表達經過純化后作為免疫原，制備兔源多克隆抗體；
2)將包被兔源多克隆抗體的酶標板進行洗滌，37℃封閉1h，洗板；
3)加入待檢血清進行孵育，洗板；
4)加入酶標抗體進行孵育，洗板；
5)加入TMB顯色液顯色，最后加入顯色終止液，終止反應；
6)利用酶標儀測定步驟5)酶標板孔中液體OD450nm值，根據臨界值判定陰陽性。
2.根據權利要求1所述的檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法，其特征在于，所述禽白血病病毒為病毒RSA株。
3.根據權利要求1所述的檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法，其特征在于，所述一對引物的引物序列如下：
p27-EcoR I-F：CGGAATTCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG；
p27-Xba I-R：GCTCTAGACCTAGGGCTGGATAGCAGAC。
4.根據權利要求1所述的檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法，其特征在于，所述包被兔源多克隆抗體的濃度為4μg/mL，包被條件為37℃2h后4℃過夜，封閉條件為37℃封閉2h。
5.根據權利要求1所述的檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法，其特征在于，所述待檢血清的反應條件為37℃作用0.5h。
6.根據權利要求1所述的檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法，其特征在于，所述酶標抗體的稀釋倍數為1:10000，反應時間為37℃作用1h。
7.根據權利要求1所述的檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法，其特征在于，所述顯示的條件為37℃作用15min。
8.根據權利要求1所述的檢測禽白血病P27的雙抗夾心直接ELISA方法，其特征在于，所述臨界值判定陰陽性的標準為：當OD450nm大于0.222是陽性，小于0.222是陰性。
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